新孢子虫GRA16和MYR2基因功能的初步研究

发布时间：2020-11-12 01:06

　　 目的制备抗新孢子虫致密颗粒蛋白NcGRA16和原癌基因调控蛋白NcMYR2多克隆抗体,对NcGRA16和NcMYR2蛋白进行亚细胞定位;构建NcGRA16基因敲除虫株(△NcGRA16)和NcMYR2基因敲除虫株(△NcMYR2),探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。方法原核表达NcGRA16和NcMYR2蛋白,纯化后免疫小鼠,制备抗NcGRA16和NcMYR2蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcGRA16和NcMYR2蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9技术构建△NcGRA16和△NcMYR2虫株,通过噬斑试验、入侵试验、增殖试验、逸出试验和动物试验探究NcGRA16和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果成功制备抗NcGRA16和NcMYR2蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcGRA16蛋白定位于虫体致密颗粒中,NcMYR2蛋白定位于虫体高尔基体;成功构建△NcGRA16和△NcMYR2虫株,与野生虫株相比△NcGRA16虫株的噬斑面积减小(P0.05);入侵率降低(P0.05)。与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcGRA16虫株的小鼠死亡时间延长3～5d;血清中IL-6和INF-γ显著下降(P0.05);脑、心和脾荷虫量显著降低(P0.05);脑和心脏病理变化减轻。感染△NcMYR2虫株的小鼠死亡时间延长1～2d;血清中IL-6水平显著下降(P0.05)。结论NcGRA16为新孢子虫入侵和毒力相关基因,敲除NcMYR2基因对虫体的生长、入侵及毒力等无明显影响,这为揭示新孢子虫致病机制和新孢子虫病防控提供了理论依据。
【部分图文】：

以上述抗体为一抗对新孢子虫进行免疫荧光试验，镜下可见NcGRA16蛋白定位于速殖子致密颗粒（图1B),NcMYR2蛋白定位于速殖子高尔基体（图1C）。2△NcGRA16和△NcMYR2虫株构建及鉴定

△NcGRA16和△NcMYR2虫株鉴定

讨论Leineweber等[14]报道新孢子虫GRA9从虫体致密颗粒分泌到纳虫空泡膜上，并可转移到宿主细胞核内。Dong等[15-16]报道新孢子虫GRA6/GRA7蛋白定位于纳虫空泡膜上，并维持纳虫空泡网络结构。但新孢子虫GRA16定位及功能尚不清楚。弓形虫TgGRA16属于外分泌蛋白，通过虫体细胞膜与纳虫空泡膜进入宿主细胞质中。TgGRA16敲除后，弓形虫入侵率降低，虫体毒力降低。TgGRA16蛋白进入宿主细胞核，与泛素特异性蛋白酶（HAUSP）或蛋白磷酸酶2(PP2A）形成高亲和力复合物。HAUSP充当肿瘤抑制因子p53稳定性的调节剂，TgGRA16与HAUSP形成的复合物上调p53抑癌通路基因，而TgGRA16与PP2A结合可下调原癌基因表达量，从而抑制宿主细胞增殖[17]。本研究结果显示，NcGRA16蛋白亚细胞定位于虫体致密颗粒，入侵后未进入宿主细胞，也未进入纳虫空泡。敲除NcGRA16基因后虫体入侵率降低，与感染野生虫株小鼠相比，感染△NcGRA16虫株的小鼠血清中IL-6、INF-γ水平下降，脑、心和脾荷虫量降低，脑和心脏病理变化减轻，显示△NcGRA16虫株对小鼠致病性减弱，表明NcGRA16与虫体入侵和毒力相关。
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本文编号：2880013