诺如病毒与寡糖结合机制的研究

发布时间：2020-11-14 07:30

　　 人诺如病毒(Humannoroviruses,,huNoVs)可以引起全世界五分之一的急性胃肠炎,感染所有人群,临床上以呕吐、腹泻、恶心、低烧为主要特征。诺如病毒(Noroviruses,,NoVs)具有遗传多样性,分为七个基因群。GⅠ和GⅡ基因群主要感染人类,根据衣壳区的命名原则至少包含35个基因型,其中,GⅡ基因群引起的流行最多,己经明确有26个基因型。huNoVs可以识别组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)作为吸附因子或受体,影响宿主易感性。大量的研究己经明确糖受体的结合特征对NoVs的流行至关重要,新流行株出现,尤其是罕见毒株发展成为主要流行株往往会发生糖结合特性的改变。因此,全面了解罕见毒株、暴发流行株以及进化出的新基因型的糖结合特性,并阐明潜在糖结合特性变化的分子基础对No Vs的预防控制具有重要意义。本研究主要分为以下三个部分:在GⅡ基因群中,GⅡ.13/21形成特异性遗传分支,使用一个全新的、非传统的糖受体结合位点(glycan binding site,GBS)与HBGAs 中的Lewis a(Lea)抗原结合。在糖结合特征中,GⅡ.13/21不同于传统GⅡ基因型而具有新GBS的优势是什么。本研究通过表型和结构分析提出有力的证据,GⅡ.13/21这种新的GBS通过共同的末端结构为β-半乳糖(β-galactose,β3-Gal)的形式识别一类寡糖。本研究发现在不同时期散发的六种GⅡ.13/21 huNoVs的P蛋白均结合三种末端结构均为β-Gal的寡糖,包括Ⅰ型前体(Lec),乳糖(lactose,Lac)以及mucin core 2;解析了 GⅡ.13 P二聚体与Lec和mucin core 2的复合物晶体结构,揭示β3-Gal是主要的糖结合位点,这些说明GⅡ.13/21的GBS有着广泛的结合谱,这是其靶向人群的优势。于此同时,发现脱脂奶粉和乳糖可以有效地抑制GⅡ.13/21 P蛋白与寡糖唾液的结合,说明脱脂奶粉和乳糖可以充当诱饵受体而抑制病毒的感染,可能导致GⅡ.13/21病毒的低流行。2016-2017年冬季一株罕见的重组毒株GⅡ.P16-GⅡ.2在多个国家暴发流行,同期出现的有GⅡ.P16-GⅡ.1。在以往的报道中,GⅡ.2和GⅡ.1不与HBGAs结合,结构解析发现GⅡ.2衣壳蛋白的Asp382和GⅡ.1衣壳蛋白的Asp375与HBGAs结合的方向发生反转。那么,由罕见毒株发展成为暴发流行株,GⅡ.2和GⅡ.1的糖受体结合情况是否发生改变。本研究中通过一系列功能实验、结构解析明确了 2016年暴发流行株GⅡ.2以及同一时间出现的GⅡ.1衣壳蛋白的糖结合特征。通过结构解析表明GⅡ.2和GⅡ.1的衣壳蛋白HBGAs结合位点对应的关键氨基酸位点Asp382和Asp375发生改变,朝向与HBGAs结合的方向。NoVs为RNA病毒,进化速率较快。GⅡ.23/24/25是最近报道的NoVs新基因型,糖受体结合特征及其相互作用分子基础仍不明确。本研究通过唾液和寡糖结合实验明确了GⅡ.23/24/25 P蛋白与HBGAs的结合特征,发现其与A/B型唾液和H双糖前体抗原结合;GⅡ.25与H双糖抗原的复合物晶体结果表明其结构特征与传统GⅡ相似,H双糖与P蛋白的结合位点位于P 二 聚体的交界面,岩藻糖作为主要结合位点。这一结果表明诺如病毒GⅡ基因群在自然选择压力下,新基因型的进化特征趋向于传统的GⅡ基因型的HBGAs结合特征。综上所述,本研究利用功能实验和结构解析扩大了 GⅡ基因群中GⅡ.13/21的结合谱,明确了其与糖抗原结合的独特机制以及流行相关性,鉴定了流行重组毒株GⅡ.P16-GⅡ.2、GII.P16-GII.1以及新基因型GII.23/24/25的糖受体结合特征。这些为huNoVs暴发流行机制,宿主病毒相互作用,疫苗及抗病毒药物研发提供参考。
【学位单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373.2
【部分图文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｈｕｍａｎ?ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ?ｇｅｎｏｍｅ??１．２诺如病毒的遗传多样性??根据完整ＶＰ１蛋白序列的多样性，ＮｏＶｓ分为七个基因群（ＧＩ－ＧＶＩＩ）（图２）??［】３’１４］。除了?ＧＩＩ基因群中ＧＩＩ．ｉｌ／１８／１９这一分支感染猪、ＧＩＶ．２感染犬类外，ＧＩ、??ＧＩＩ、ＧＩＶ基因群主要引起人的感染，其中，ＧＩ和ＧＩＩ基因型是引起ｈｕＮｏＶｓ的??主要基因型，ＧＩＶ基因型在流行以及散发案例中检出减少。ＧＩＩＩ基因簇主要感染??牛羊动物，ＧＶＩ．１感染鼠类，ＧＶ．２感染兔，ＧＩＶ．２感染猫和犬类［１５］，ＧＶＩ和ＧＶＩＩ??感染犬类。最近报道中，根据聚合酶去和衣壳区序列的双命名原则，ＧＩＩ基因簇??的衣壳区出现了?ＧＩＩ．２３／２４／２５／２６四株新的基因型，以及三株初步认定的基因型，??ＧＩＩ．ＮＡ１－ＧＩＬＮＡ３［ｉ６１８］。??１．３诺如病毒的病原学及流行病学特征??ＮｏＶｓ成为一种常见的病原体是由许多因素导致，比如，感染剂量较低，少??于２０个病毒颗粒即可使人群感染Ｎ〇Ｖｓ［１９］；患病期间

分别在?ａ－１．２?岩藻糖转移酶（ａ－ｌ，２ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＦＵＴ２）、ａ－１，３／４?岩藻??糖转移酶（ａ－ｌ，３／４ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，?ＦＵＴ３）、Ａ／Ｂ?糖基转移酶（ＡｏｒＢｅｎｚｙｍｅｓ）??下催化而成（图３）。山于多个二糖前体以及ＨＢＧＡｓ的三个家族含有沉默等位基??因可能导致基因座上的显性基因无效，所以人群中ＨＢＧＡｓ表型具有多态性。例??６??

将过夜培养的菌体以丨：１００的比例加入大的三角瓶中，按照小表达方法的??留取超声破碎后的上清液进行蛋白纯化。所有重组蛋白都要经过ＧＳＴ亲和层析??纯化和酶切，经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后，在约３６ＫＤａ处可见目的蛋白（图１．１），??Ｐ颗粒测定浓度后即可用于功能实验。??／?“?／?／?／?／＃?，?／?／?／??／／／／／／?／＃／／／＃?／?／／??８０?Ｓ?８０??ＣＯ．?．???，??５８?必？如？一?ｍｍｍ?＊？＞？＊＊?－?ａ??＾?，?４６??。?働雜■？麵騰義一＊擊一—痛一??２５?｜ａＫｅ？?２￥懂：??２２：｜＾－?２２＿??图１．１?Ｐ颗粒蛋白纯化??Ｍ：蛋白分子量标准??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐ?Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ?Ｐｒｏｔｅｉｎｓ??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｍａｓｓ?ｍａｒｋｅｒ??ＳＣＩ?０６５、ＳＣＩ０６５／２９７、０８Ｎ２０４５?Ｐ?ｄｉｍｅｒ蛋白在ＧＳＴ亲和层析之后，再由凝??胶过滤层析进一步纯化，使用ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００】０／６００ＧＬ柱进行纯化，ＵＶ２８０曲线在??４２??
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本文编号：2883242