Setd2通过抑制RNA多聚酶Ⅱ的延长维持成年造血干细胞的正常功能

发布时间：2020-11-14 23:33

　　 SET domain containing 2(Setd 2)基因编码合成组蛋白H3K36甲基转移酶,其功能缺失性突变与白血病、淋巴瘤等血液系统疾病均相关。Setd2在胚胎发育中具有重要作用,但其在造血系统中的作用仍不明确。因此,我们利用Cre-LoxP系统,通过敲除Setd2基因第6外显子构建了血液系统条件性敲除的小鼠模型,并利用该模型阐述了Setd 对维持正常成年造血干细胞具有重要的作用。Setd2敲除小鼠表现有白细胞减少、巨细胞性贫血、血小板增高,同时伴有骨髓有核细胞减少、红系病态造血,以及骨髓低级别纤维化。Setd2敲除小鼠骨髓造血干细胞及除红系以外的造血祖细胞数量均较对照组显著减少,同时伴有红系、巨核系、淋巴系的分化异常。除了数量上的异常,Setd2敲除的小鼠干细胞在移植后在受体内不能重建骨髓,相关功能实验结果表明其不能维持正常静息状态,凋亡增多,多能分化潜能减低。同时生物信息相关分析也表明了Setd2敲除后,造血干细胞内分化相关信号通路显著上调,造血干细胞不能维持正常的静息状态进而进入细胞周期走向分化,最终导致了干细胞衰竭。分子机制上,我们认为正常Setd2在小鼠造血干细胞中抑制了Nsd1/2/3相关转录复合物,Nsd1/2/3可以招募转录延长复合物(SEC)/Dotll并且调控RNA多聚酶Ⅱ的相关功能,从而调控了包括Myc在内的一群对干细胞具有重要作用的基因。当运用SEC/Dot1l相关组分抑制剂时,Setd2敲除干组细胞的功能异常及Myc等蛋白表达水平的异常均可被部分挽救。本研究揭示了 H3K36组蛋白甲基转移酶Setd2通过限制NSDs/SEC介导的RNA多聚酶Ⅱ的延长从而维持了成年造血干细胞的正常功能。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

浙江大学博士学位论文?正文第－部分材料与方法??１．２．４实验方法??１．２．４．１?ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９?构建小鼠??ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９构建ＳＷｔ／２〃（Ｂ６，ＣＤ４５．２）小鼠由美国辛辛那提儿童医院医??疗中心的转基因中心完成。两个Ｌｏｘｐ位点分别被插入到５ＷＪ２第６外显子的两端。??分有两个重要的、高度保守的结构域：ＳＥＴ结构域，ＳＲＩ结构域。ＳＥＴ结构域??是负责组蛋白甲基转移酶活性的催化结构域，而ＳＲＩ结构域则可以与ＲＮＡｐｏｌ?ＩＩ??结合。其中第６外显子就位于ＳＥＴ结构域中。在Ｃｒｅ的作用下，沿第６外显??子的敲除会导致框移哭变以及哭变ｍＲＮＡ的无义衰变（ｎｏｎ－ｓｅｎｓｅ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｄｅｃａｙ，??ＮＭＤ），最终导致整个Ｓｅｔｄ２蛋白质的缺失（图１．２．１）。??ＡＷＳ?ＳＥＴ?ｐｏｓｌ－ＳＥＴ?ＷＷ?ＳＲＩ??

２ｘＴａｋａｒａ?ＰＣＲ?ｍａｓｔｅｒ?ｍｉｘ?７．５｜ａｌ??ｐｒｉｍｅｒｓ?（Ｆ＋Ｒ）?２ｊｘｌ??ＤＮＡ?＼［ｉｌ??Ｈ２０?４．５＾??总体积?１５ｐｌ??ＰＣＲ?反应条件为：９５°Ｃｘ２ｍｉｎ?预变性，（９５°Ｏ２０ｓ，?６５°Ｃｘ３０ｓ，７２°Ｏ９０ｓ）?ｘ３５，??７２°Ｃｘ５ｍｉｎ?终延伸。??根据Ｌｏｘｐ插入位点（图１．２．２），基因型鉴定的引物设计如下：??Ｐ１?－ＴＧＧＧＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＣ?ＡＡＴＡＴＣＴＣ，??Ｐ２－ＴＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＴＡＣ，??Ｐ３－ＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＣＧＧＡＡＣ，??Ｐ４－ＴＴＣＴＧＧＧ?ＡＡＴＣ?ＡＴＣＣ?ＡＴＧＧＴ。??

图１．３．１?ＰＣＲ鉴定Ｌｏｘｐ插入??
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本文编号：2884072