寨卡病毒突变株的构建和减毒株的初步筛选

发布时间：2020-11-15 09:58

　　 [目的]本研究首先分析寨卡病毒亚洲型和非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、prM核苷酸和氨基酸序列差异,以登革的毒力位点作为寨卡的参考,探究Ⅲ型登革病毒在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响,在病毒毒力与位点突变有相关性的基础上,利用反向遗传学技术构建寨卡病毒突变株并进行寨卡减毒株的初步筛选。[方法]分别选择五个不同的寨卡病毒亚洲型和非洲型全长基因组序列,并获得它们相应的氨基酸序列,采用BIOEDIT软件进行比对,分析相似度,统计不同型别间结构蛋白C、prM的核苷酸突变和氨基酸替代位点;将两株Ⅲ型登革病毒在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种到Vero细胞上连续传代培养,用Ⅲ型登革标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,并通过RCR扩增全长获得全长序列,与原代病毒序列比对;将寨卡全长克隆质粒进行分析,并结合登革的毒力位点,确定寨卡基因组上可操作的毒力位点,利用定点突变的方式将寨卡全长克隆质粒上的毒力位点突变,得到突变质粒,将改造后的骨架进行体外转录,转染到Vero细胞拯救病毒,拯救出来的病毒利用RT-PCR、免疫荧光鉴定、拯救病毒增殖特性分析、蚀斑实验、成鼠乳鼠接种实验鉴定其生物学特征。[结果]寨卡病毒亚洲型和非洲型的核酸相似性在88.00%-89.00%之间,不同型别的结构蛋白C和prM碱基的突变比较显示C基因一共有19个碱基突变,prM基因一共有48个碱基突变,氨基酸翻译比对显示这67个碱基突变均为有效突变。优选出一株Ⅲ型登革病毒在C6/36上毒力增强(P17-C6/36),后在Vero细胞上毒力减弱(P10-Vero),全基因分析PO、P17-C6/36、P10-Vero发现全长碱基共有16处发生突变,导致了 12个氨基酸的非同义突变。其中,碱基第5826位点、第6251位点、第7907位点均表现为P0和P10-Vero碱基相同,而P17-C6/36碱基发生突变,且对应的氨基酸位点第1942位点、第2084位点、第2636位点均发生非同义突变,寨卡毒力位点分析显示可进行一个减毒位点的突变和四个增毒位点的突变,成功构建并拯救寨卡突变病毒 Pzika-FL-G53D、Pzika-FL-T47S、Pzika-FL-S64T、Pzika-FL-V255A、Pzika-FL-S260T,并初步表明 Pzikv-FL-G53D 较 Pzikv-FL 在细胞水平上有一定的减毒效果,通过两日龄乳鼠寨卡注射实验显示Pzikv-FL-G53D较Pzikv-FL具有更低的神经毒力。[结论]单位点的突变可能对病毒株的致病性、感染性等造成影响,传代细胞更换对登革病毒的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为研究寨卡病毒生物学和致病性差异提供参考,为后续寨卡病毒减毒策略的研究提供了基础。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373
【部分图文】：

得样品Ｃｔ值、标准品质粒的标准曲线方程ｙ＝＿０．２３８１ｘ＋１０．６５２，计算得到样品的拷??贝浓度（病毒拷贝数／ｕｌ上清）（表３），并绘制ＰＯ、Ｐ１７－Ｃ６／３６、Ｐ１０－Ｖｅｒｏ病毒载量??图（见图５），由图可知，ＩＩＩ型登革病毒ＤＶ３－１在Ｐ１７－Ｃ６／３６时有着较高的病毒拷贝??数，而在Ｐ０及ＰｌＯ－Ｖｅｒｏ时病毒拷贝数偏低。??１０．００??＾?８．００??＾?６．。。??－?４．０。??￡?ｙ?＝?－０．２３８１ｘ＋?１０．６５２??２．００?Ｒ：?＝?０．９９８５??０．００??０?１０?２０?３０?４０??（－＇Ｔ?位??图４?ｉｎ型登革病毒标准品标准曲线??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｔｙｐｅ?Ｕｌｄｅｎｇｕｅ?ｖｉｒｕｓ?ｓｔａｎｄａｒｄ??１８??

３．２寨卡病毒突变株的构建??通过两段法扩增，每个突变点的ＡＢ段均被有效地扩增出，均在７０００ｂｐ左右，??如下（图９）所示，产物去除甲基化模板质粒后，测得浓度和纯度分别如下：Ｇ５３Ｄ－１??浓度?６９．０ｎｇ／ｕｌ，纯度?０Ｄ２６０／ＯＤ２８０＝１．８２；?Ｇ５３Ｄ－２?浓度?５４．４ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．７５；?Ｔ４７Ｓ－１??浓度?１４６．２ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．８１；?Ｔ４７Ｓ－２?浓度?６７．７ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．８３；?Ｓ６４Ｔ－１?浓度?８１．４ｎｇ／ｕｌ，??纯度?１．７４；?Ｓ６４Ｔ－２?浓度?８７．６ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．７７；?Ｖ２５５Ａ－１?浓度?３３．７ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．８３；??Ｖ２５５Ａ－２?浓度?５７．７ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．８２；?Ｓ２６０Ｔ－１?浓度?１０７．６ｎｇ／ｕｌ，纯度?１．８４；?Ｓ２６０Ｔ－２??浓度２３．７ｎｇ／ｕｌ，纯度１．９，各回收产物均满足下一步骤连接的纯度和浓度，连接转??化平板均有单克隆长出，表现为Ｇ５３Ｄ长出一个单克隆；Ｔ４７Ｓ长出２个单克隆；??Ｓ６４Ｔ长出５个单克隆；Ｖ２５５Ａ长出２３个单克隆；Ｓ２６０Ｔ长出２７个单克隆，将各??突变点单克隆扩増小提质粒

各重组质粒经限制性内切酶Ｃｌａ?Ｉ、Ｎｏｔ?Ｉ双酶切后，用６＞＜Ｌｏａｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ终止??反应，取１０ｕｌ酶切产物上样电泳（ｌ％Ａｇａｒｏｓｅ），用凝胶成像仪成像均得到１０８０８ｂｐ??的片段和３４６６ｂｐ的片段，如下图１０所示，与预期相符。??Ｍｌ?质Ｔ４７ＳＴ４７Ｓ?Ｓ６４Ｔ?Ｖ２５５ＡＳ２６０Ｔ??ＩＩ??．１１??Ｍｌ．?ＤＬ２００００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ２．?ＤＬ１００００?Ｍａｒｋｅｒ；??质Ｔ４７Ｓ：突变质粒Ｔ４７Ｓ??图１０酶切鉴定突变株??Ｆｉｇ?１０．?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔｓ?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．３．２测序鉴定??将测序结果进行拼接，各突变重组质粒与原质粒进行序列比对，如图１１所示，??成功将ＦＳＳ１３０２５上ＮＳ１第５３个氨基酸由甘氨酸（ＧＧＧ）突变为天冬氨酸（ＧＡＣ）；??成功将ＦＳＳ１３０２５?Ｅ第４７个氨基酸由苏氨酸（ＡＣＡ）突变为丝氨酸（ＴＣＡ）；成功将??ＦＳＳ１３０２５Ｅ第６４个氨基酸由丝氨酸（ＴＣＡ）突变为苏氨酸（ＡＣＡ）；成功将ＦＳＳ１３０２５??Ｅ第２５５个氨基酸由缬氨酸（ＧＴＣ）突变为丙氨酸（ＧＣＣ）；成功将ＦＳＳ１３０２５?Ｅ第??２６０个氨基酸由丝氨酸（ＡＧＴ）突变为苏氨酸（ＡＣＴ）
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本文编号：2884635