胞红蛋白对巨噬细胞氧化损伤的保护作用

发布时间：2017-04-06 09:08

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【摘要】：[目的]胞红蛋白(cytoglobin,CYGB)是一种新发现的携氧球蛋白,CYGB在神经细胞缺氧时表达明显增加并具有明显的细胞保护作用。本文探讨巨噬细胞氧化应激过程中CYGB表达模式;构建CYGB过表达/低表达巨噬细胞模型,研究CYGB在氧化应激过程中对巨噬细胞的作用。[方法]1、将小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人巨噬细胞株THP-1、EC及人肝癌细胞Hep G2扩增后,Western blot检测正常生理状态下RAW264.7、THP-1、EC及Hep G2细胞中CYGB蛋白的表达水平。2、将小鼠巨噬细胞株RAW264.7扩增后,Western blot检测RAW264.7在H2O2刺激不同时间时CYGB的蛋白表达水平:分为4组:对照组,0.5mmol/L H2O2处理6、12、24 h组。Western blot检测RAW264.7在不同浓度H2O2刺激12h时CYGB蛋白的表达水平:分为4组:对照组,0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2、1mmol/L H2O2处理组。3、首先构建CYGB过表达/低表达巨噬细胞模型。然后观察在氧化应激过程中CYGB对RAW264.7小鼠巨噬细胞的作用,将RAW264.7细胞分为4组:对照组、0.5mmol/L H2O2处理组、0.5mmol/L H2O2+CYGB过表达组及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表达组。于12h后,检测CYGB蛋白水平、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、乳酸脱氢(LDH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD);荧光定量PCR检测CYGB、NF-κB在细胞中的表达。[结果]1、Western blot结果显示:在正常生理状态下,CYGB在小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人巨噬细胞株THP-1、人脐静脉内皮细胞EC及人肝癌细胞Hep G2中均有表达。2、Western blot结果显示:H2O2处理6、12、24 h组CYGB表达水平高于对照组,并且在12h组CYGB表达水平最高,差异有统计学意义(P0.05)。0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2和1mmol/L H2O2处理巨噬细胞12h后CYGB表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。3、荧光显微镜结果显示:转染CYGB过表达质粒及CYGB低表达质粒的巨噬细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。4、Western blot结果显示:0.5mmol/L H2O2处理组、0.5mmol/L H2O2+CYGB过表达组及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表达组CYGB蛋白表达水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05)。0.5mmol/L H2O2+CYGB过表达组的CYGB表达最高(P0.05),0.5mmol/L H2O2+CYGB低表达组的CYGB表达较0.5mmol/L H2O2处理组低,差异有统计学意义(P0.05)。酶联免疫吸附测定法(ELISA)和ROS检测结果显示:与0.5mmol/L H2O2相比,0.5mmol/L H2O2+CYGB过表达组中GSH-PX、SOD升高,LDH、MDA、ROS下降;与0.5mmol/L H2O2组相比,0.5mmol/L H2O2+CYGB低表达组中GSH-PX、SOD下降,LDH、MDA、ROS升高。荧光定量PCR检测显示:与正常对照组比较,H2O2处理组CYGB和NF-κB表达均上调(P0.05)。与H2O2对照组比较,CYGB过表达组CYGB表达较高,NF-κB表达较低(P0.05);CYGB低表达组CYGB表达较低,NF-κB表达较高(P0.05)。[结论]1.CYGB在巨噬细胞中表达,在H2O2刺激时表达水平增加。2.CYGB在巨噬细胞氧化应激损伤过程中具有细胞保护作用。
【关键词】：巨噬细胞 氧化应激 胞红蛋白 H2O2
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.12
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-20
• 1.1 前言14-18
• 1.2 技术路线18-20
• 第2章 实验材料20-22
• 2.1 细胞株20
• 2.2 主要试剂20
• 2.3 主要仪器20-21
• 2.4 数据处理和分析21-22
• 第3章 实验方法22-40
• 3.1 细胞培养22-23
• 3.1.1 细胞复苏22
• 3.1.2 细胞传代22-23
• 3.1.3 细胞冻存23
• 3.2 实验分组23-24
• 3.3 CYGB在各种细胞中的表达24-26
• 3.3.1 试剂配制24-25
• 3.3.2 蛋白提取25
• 3.3.3 蛋白定量25
• 3.3.4 SDS-PAGE电泳25-26
• 3.4 H_2O_2处理巨噬细对CYGB表达的影响26-27
• 3.4.1 H_2O_2处理RAW264.7 不同时间对CYGB表达的影响26-27
• 3.4.2 不同浓度H_2O_2处理RAW264.7 对CYGB表达的影响27
• 3.5 CYGB过表达和低表达巨噬细胞模型的构建和鉴定27-31
• 3.5.1 溶液的配制27-28
• 3.5.2 培养受体菌28
• 3.5.3 制备感受态细胞28
• 3.5.4 质粒的转化28
• 3.5.5 质粒的提取28-30
• 3.5.6 细胞转染30-31
• 3.6 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的测定31-32
• 3.6.1 试剂组成及配制31
• 3.6.2 样本的前处理31
• 3.6.3 细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力测定操作表31-32
• 3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测32-33
• 3.7.1 试剂组成与配制32-33
• 3.7.2 样本的前处理33
• 3.7.3 细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性检测操作表33
• 3.8 乳酸脱氢酶(LDH)活性检测33-34
• 3.8.1 试剂组成及配制33-34
• 3.8.2 样本的前处理34
• 3.8.3 培养基中乳酸脱氢酶(LDH)检测操作表34
• 3.9 丙二醛(MDA)活性检测34-35
• 3.9.1 试剂的组成与配制34-35
• 3.9.2 样品前处理35
• 3.9.3 细胞中丙二醛(MDA)活性检测操作表35
• 3.10 活性氧(ROS)活性检测35-36
• 3.10.1 试剂组成及保存35-36
• 3.10.2 操作步骤36
• 3.11 荧光定量PCR检测CYGB、NF-κB在细胞中的表达36-40
• 3.11.1 溶液配制36
• 3.11.2 RNA提取36-37
• 3.11.3 RNA反转录37-38
• 3.11.4 荧光定量-PCR38-40
• 第4章 实验结果40-52
• 4.1 细胞形态学观察结果40-41
• 4.2 CYGB在各种细胞中的表达41
• 4.3 H_2O_2处理RAW264.7 对CYGB表达的影响41-43
• 4.3.1 H_2O_2处理RAW264.7 不同时间对CYGB表达的影响41-42
• 4.3.2 不同浓度H_2O_2处理RAW264.7 对CYGB表达的影响42-43
• 4.4 CYGB过表达和低表达巨噬细胞模型的构建和鉴定43-45
• 4.5 CYGB对H_2O_2处理的巨噬细胞的保护作用45-51
• 4.5.1 H_2O_2处理对RAW264.7 细胞CYGB表达的影响45-46
• 4.5.2 CYGB对RAW264.7 细胞GSH-PX活性影响46-47
• 4.5.3 CYGB对RAW264.7 细胞SOD活性影响47-48
• 4.5.4 CYGB对RAW264.7 细胞LDH活性影响48-49
• 4.5.5 CYGB对RAW264.7 细胞MDA活性影响49-50
• 4.5.6 CYGB对RAW264.7 细胞ROS活性影响50-51
• 4.6 荧光定量PCR检测NF-κB在细胞中的表达51-52
• 第5章 讨论52-56
• 第6章 结论56-58
• 参考文献58-62
• 文献综述62-72
• 参考文献68-72
• 作者攻读学位期间的科研成果72-74
• 致谢74-75
• 本研究基金资助项目75

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 张国阳;李道江;揭志刚;李正荣;;胃癌相关DNA甲基化的研究进展[J];广东医学;2014年19期

2 徐中菊;张悦;舒适;李志杰;张瑞义;;胞红蛋白研究进展[J];现代生物医学进展;2015年10期

3 纪莎;玛依努尔·尼牙孜;;DNA甲基化与宫颈癌研究进展[J];中国优生与遗传杂志;2014年03期

4 李新敏;古雅丽;王香芝;郭华锋;宫宏宇;;p16、DAPK和ESRβ基因启动子甲基化与宫颈癌的关系[J];诊断病理学杂志;2015年02期

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本文编号：288606