WTH3多克隆抗体的制备及其鉴定

发布时间：2017-04-06 14:07

  本文关键词：WTH3多克隆抗体的制备及其鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景肿瘤的多药耐药性已经成为当今肿瘤治疗主要的失败原因,是肿瘤化疗最主要的障碍。细胞耐药机制因其所用的药物种类以及肿瘤类型的不同而有所差异。不同类型的肿瘤对同种药物的耐药机制不同,并且同种肿瘤对同种药物也有多种的耐药机制。DNA甲基化是一种重要的遗传修饰机制,其与肿瘤的发生发展及肿瘤治疗等方面有紧密的相关性,是常见的抑癌基因失活机制,甚至在某些特定的情况下单一的甲基化修饰就可以促使恶性肿瘤的形成。由于基因的转录受到DNA甲基化状态下产生的特异性基因位点与启动子结合的影响,因此在DNA甲基化状态下产生基因序列的改变后会产生特定的甲基化序列结合蛋白进而影响肿瘤的多药耐药。在进一步研究DNA甲基化与肿瘤多药耐药性之间的关系时发现了抗耐药基因WTH3。研究发现,耐药细胞株与非耐药细胞株相比,WTH3的甲基化水平显著不同。之后对该基因进行进一步研究发现该基因是由254个氨基酸组成的G蛋白。由于WTH3的-COOH末端的半胱氨酸翻译后缺少修饰,所以不能结合到细胞膜上,而大部分分布于细胞质中,少部分在细胞核内。相关资料表明,WTH3的参与细胞的MDR具有普遍性。为了进一步研究WTH3的细胞生物学功能,我们急需制备出WTH3蛋白的特异性抗体。目前市场上还没有作用较好的商品化抗人WTH3的抗体,因此我们着手制备了WTH3的抗体,为进一步的研究奠定基础。实验方法本实验首先利用RT-PCR验证WTH3m RNA在SKOV3/SKOV3-DDP细胞系中存在表达,之后利用电脑筛选基因全长中蛋白表达区域中外露的抗原决定簇,制备多肽片段,并与cys偶联后作为抗原,与佐剂混合后免疫新西兰白兔,达到免疫效价后,提取免疫后血清纯化后得到多克隆抗体,并进行ELISA,Western-Blot免疫印迹实验、细胞免疫荧光实验对该抗体进行鉴定。实验结果本实验利用人工合成的多肽片段,免疫实验用兔,第三次免疫后ELISA结果显示所得多克隆抗体抗体效价较高,再次进行加强免疫后,ELISA检测抗体效价可达2.0×105U以上,可以用于实验室检测。利用所制备抗体进行免疫印迹实验时,制备抗体可以识别组织中WTH3蛋白,证明所得抗体可以用于实验室Western-Blot检测WTH3蛋白。实验结论1.本实验利用抗原免疫动物后,得到了效价较高的抗体。2.本实验制备的WTH3抗体在Western-Blot免疫印迹实验中能够特异性检测到WTH3蛋白。
【关键词】：WTH3 多克隆抗体 DNA甲基化 抗体制备 MDR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词表8-12
• 第一章 绪论12-20
• 1.1 研究背景12-14
• 1.1.1 WTH312
• 1.1.2 甲基化及CpG岛12-13
• 1.1.3 MDR13
• 1.1.4 甲基化与MDR的关系13-14
• 1.2 抗体14-15
• 1.2.1 抗体的分类14
• 1.2.2 多克隆抗体与单克隆抗体14
• 1.2.3 多克隆抗体与单克隆抗体比较14-15
• 1.3 抗体制备15-18
• 1.3.1 多克隆抗体制备15-16
• 1.3.2 单克隆抗体制备16-18
• 1.3.3 基因工程抗体制备18
• 1.4 抗体纯化18-20
• 第二章 材料与方法20-34
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 细胞系20
• 2.1.2 实验动物20
• 2.1.3 主要仪器及设备20-21
• 2.1.4 主要试剂21
• 2.1.5 主要试剂配制21-23
• 2.2 实验方法23-34
• 2.2.1 细胞培养技术23-24
• 2.2.2 RT-PCR检测WTH3mRNA表达24-26
• 2.2.3 抗体制备26-28
• 2.2.4 硫酸铵盐析法抗体纯化28-29
• 2.2.5 间接ELISA法检测抗体效价29-30
• 2.2.6 Western Blot检测WTH3蛋白表达30-32
• 2.2.7 免疫荧光32-34
• 第三章 实验结果34-41
• 3.1 细胞培养34
• 3.2 RT-PCR法检测WTH3 MRNA的表达34-35
• 3.3 抗原肽段筛选及合成35-36
• 3.4 第三次免疫后抗体效价检测36-37
• 3.5 纯化后抗体效价37-39
• 3.6 WTH3的表达39-41
• 3.6.1 Westen-Blot免疫印迹39
• 3.6.2 细胞免疫荧光39-41
• 第四章 讨论41-43
• 4.1 PCR检测WTH3 MRNA表达41
• 4.2 抗人工合成多肽片段抗体制备41-42
• 4.3 抗体纯化42
• 4.4 抗体鉴定42-43
• 第五章 结论43-44
• 参考文献44-50
• 作者简介50-51
• 致谢51

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