蜡样芽胞杆菌plcR基因功能及其无义突变株特征分析
发布时间：2020-11-16 20:42
目的分析比较蜡样芽胞杆菌HN001与plcR基因无义突变株HN1M的生物特征,并研究蜡样杆菌中plcR基因的功能。方法绘制生长曲线比较蜡样杆菌HN001和HN1M的生长性能;鉴别培养基平板比较两菌株产胞外酶能力;结晶紫染色法测定两菌株生物膜形成;RT-PCR分析两菌株中溶血酶、磷脂酶和肠毒素基因的转录水平;以C57BL/6N小鼠为动物模型比较两菌株的毒力大小。结果与HN001相比,HN1M稳定期菌密度和生物膜形成能力显著升高,溶血能力、产卵磷脂酶能力和对小鼠致病性显著减弱;HN1M中毒力基因hlyD、clO、hly、cerA、cerB、plcA、cytK、nhe和hblCDB转录水平显著下调;tlyA和hblA转录水平无显著差异。结论与HN001相比,蜡样杆菌plcR基因无义突变株HN1M溶血酶和磷脂酶的活性明显降低,毒力明显减弱,该研究为开发蜡样杆菌工程菌和研究plcR的功能提供了新思路。
【部分图文】：
蜡样杆菌能产生卵磷脂酶、淀粉酶、蛋白酶等非特异性毒力因子。本研究采用MYP平板、淀粉平板、牛奶平板检测HN1M产生胞外酶的能力。细菌利用甘露醇产酸MYP平板中的酚红变黄，产卵磷脂酶分解平板中的卵黄会产生粉红色沉淀环。淀粉平板上细菌生长24 h后加碘液，平板变蓝，细菌产生淀粉酶利用淀粉产生透明环。牛奶平板呈乳白色，细菌产生蛋白酶利用脱脂奶粉产生透明环。将MYP平板、淀粉平板和牛奶平板分区，分别滴加T3时期D600值为0.05的HN001、HN1M和S05菌液，37℃条件下培养24 h，观察菌落颜色及成环情况。1.2.3 结晶紫染色法测生物膜形成能力
生长曲线显示，与HN001相比，plcR无义突变株HN1M稳定期菌量高，经重复性测量方差分析发现，两种菌的生长状况有显著差异（F=19.705,P=0.011，图2）。重复测量不同时间点有显著差异（F=6700.70,P<0.0001），重复测量时间点与不同菌株间交互作用有统计学意义（F=9.895,P=0.002）。稳定期细菌密度高时PapR开始表达并积累，CodY通过调节PapR的导入间接抑制PlcR-PapR，因此推测PlcR无义突变影响PapR表达，密度感应迟缓，导致HN1M稳定期菌量显著升高。2.2 HN001、S05和HN1M产胞外酶和形成生物膜能力的比较
3组（S05、HN001、HN1M）总RNA提取效果良好，可用于RT-PCR检测。与HN001中各基因相比，HN1M中除tlyA和hblA基因无差异外，其他基因的相对转录水平均显著下调（图4）。推测plcR正调控基因hlyD、clO、hly、cerA、cerB、plcA、cytK、nhe和hblCDB，但可能不调控基因tlyA和hblA。PlcR box分析显示，clO、plcA、cerAB和cytK的PlcR box位于100～300 bp区域，nhe操纵子基因的PlcR box位于nheA基因起始密码子上游527～543 bp,hbl操纵子基因的PlcR box位于hblC基因起始密码子上游879～895 bp,PlcR对其调控可能也受结合位置的影响[9]。图4 HN001、HN1M毒力基因相对转录水平
【相似文献】
本文编号：2886644
【部分图文】：
蜡样杆菌能产生卵磷脂酶、淀粉酶、蛋白酶等非特异性毒力因子。本研究采用MYP平板、淀粉平板、牛奶平板检测HN1M产生胞外酶的能力。细菌利用甘露醇产酸MYP平板中的酚红变黄，产卵磷脂酶分解平板中的卵黄会产生粉红色沉淀环。淀粉平板上细菌生长24 h后加碘液，平板变蓝，细菌产生淀粉酶利用淀粉产生透明环。牛奶平板呈乳白色，细菌产生蛋白酶利用脱脂奶粉产生透明环。将MYP平板、淀粉平板和牛奶平板分区，分别滴加T3时期D600值为0.05的HN001、HN1M和S05菌液，37℃条件下培养24 h，观察菌落颜色及成环情况。1.2.3 结晶紫染色法测生物膜形成能力
生长曲线显示，与HN001相比，plcR无义突变株HN1M稳定期菌量高，经重复性测量方差分析发现，两种菌的生长状况有显著差异（F=19.705,P=0.011，图2）。重复测量不同时间点有显著差异（F=6700.70,P<0.0001），重复测量时间点与不同菌株间交互作用有统计学意义（F=9.895,P=0.002）。稳定期细菌密度高时PapR开始表达并积累，CodY通过调节PapR的导入间接抑制PlcR-PapR，因此推测PlcR无义突变影响PapR表达，密度感应迟缓，导致HN1M稳定期菌量显著升高。2.2 HN001、S05和HN1M产胞外酶和形成生物膜能力的比较
3组（S05、HN001、HN1M）总RNA提取效果良好，可用于RT-PCR检测。与HN001中各基因相比，HN1M中除tlyA和hblA基因无差异外，其他基因的相对转录水平均显著下调（图4）。推测plcR正调控基因hlyD、clO、hly、cerA、cerB、plcA、cytK、nhe和hblCDB，但可能不调控基因tlyA和hblA。PlcR box分析显示，clO、plcA、cerAB和cytK的PlcR box位于100～300 bp区域，nhe操纵子基因的PlcR box位于nheA基因起始密码子上游527～543 bp,hbl操纵子基因的PlcR box位于hblC基因起始密码子上游879～895 bp,PlcR对其调控可能也受结合位置的影响[9]。图4 HN001、HN1M毒力基因相对转录水平
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1 陈恬;SezAT系统及PlcR转录调控因子在2型猪链球菌中的作用研究[D];第三军医大学;2014年
本文编号：2886644
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