HO-1对大鼠移植肝胆道缺血再灌注损伤的保护作用研究

发布时间：2020-11-17 08:27

　　 [背景和目的]肝脏移植已成为终末期肝病的主要治疗方式,但移植肝胆道缺血再灌注损伤引起的胆道并发症是影响肝移植远期疗效的主要原因之一。因此,减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤是目前改善移植受者预后和存活率的首要策略。HO-1是血红素代谢的限速酶,有高度的可诱导性,具有抗氧化、抗炎、调节细胞周期和调节微循环的功能,但诱导HO-1的表达是否可以减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤,且肝移植是将供体肝脏移植给受体,应该先处理供体还是受体才能发挥更大的保护作用仍不清楚。本研究拟通过建立大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤模型,构建大鼠H0-1过表达腺病毒载体和借助RNAi技术构建靶向HO-1-shRNA腺病毒载体,转入大鼠活体内诱导或沉默HO-1基因的表达,观察HO-1对移植肝胆汁分泌、转运能力的影响,同时分析HO-1与胆管上皮细胞损害、胆管炎发生及胆管上皮周围纤维化进程的内在关系,并通过改变供体和(或)受体HO-1表达来观察其对胆道缺血再灌注损伤的影响,为临床上改善肝移植术后缺血型胆道病变提供新的思路和方法。[方法]1.构建大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并分别转入大鼠体内,24h后取出肝脏,利用Westem-blot检测HO-1蛋白表达水平,观察体内转染效果。2.大鼠原位肝移植模型的建立:根据Kamada的“二袖套法”,建立大鼠原位肝移植模型,观察术中、术后并发症及术毕24h后存活率,并取3只作为手术组与正常组大鼠比较光镜下肝脏组织形态学变化,证实大鼠肝移植缺血再灌注模型建立成功。3.大鼠体内实验研究:将320只SD大鼠按供、受体随机选取分为5组(每组供、受体各32只),分别为A组(空白腺病毒)、B组(供体注射Adv-HO-1,受体注射空白腺病毒)、C组(供、受体均注射Adv-HO-1)、D组(供体注射Adv-HO-1-siRNA,受体注射空白腺病毒)和E组(供、受体均注射Adv-HO-1-siRNA)。各组于术前24h尾静脉分别注射空白腺病毒、Adv-HO-1、Adv-HO-1-siRNA各lml,浓度均为3×108pfu/ml。肝移植后收集lh内胆汁检测其成分,分别于术后1d、3d、7d、14d处死受体,全自动生化分析仪检测肝功酶学(ALT、AST、ALP、GGT、TBIL),免疫组化检测 CD3+、CD45R+T淋巴细胞的浸润程度和ki67标记胆管上皮细胞增殖情况,光镜和透射电镜下观察肝脏及胆管组织形态学变化,激光共聚焦双重免疫荧光标记Laminine和CK-18,观察大、小胆管基底膜的破坏程度和连续性,检测胆汁成分并用Western-blot 分析 HO-1、Bsep、Mrp2、Ntcp 的蛋白含量。[结果]1.腺病毒转染效果检测:成功构建Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,经测序证明扩增序列正确,转染大鼠体内显示:与空病毒组相比,诱导组HO—1的蛋白表达水平上调,抑制组HO—1的蛋白表达水平下降,差异均有统计学意义(P0.05)。2.模型建立结果:一共行大鼠原位肝移植175例,肝移植术中各种原因死亡者及术后24h内死亡者共计12例,以术后存活24h视为手术成功,手术成功163例。各组之间死亡例数无统计学差异(p0.05),24h后存活率约为93%(163/175)。光镜下观察手术组与正常组大鼠组织形态学变化,发现手术组组织形态学变化符合缺血再灌注损伤,证明模型建立成功。3.体内实验结果:①肝功酶学:再灌注后1d、3d、7d和14d,与A组比较,B、C 组 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL 明显下降,D、E组 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL明显升高,差异有统计学意义(P0.05);②免疫组化检测:再灌注后ld,E组CD3+、CD45R+T淋巴细胞等炎性细胞在汇管区浸润较A组增多,C组的炎性细胞浸润较A组减少;7d时E组ki67抗体标记胆管上皮细胞坏死、脱落、增殖较明显,C组ki67抗体标记胆管上皮细胞坏死、增殖不明显,胆管反应轻;③光镜下病理组织学变化:A组、B组和C组肝细胞变性、水肿,有炎性细胞浸润;D组和E组肝小叶结构明显紊乱,肝细胞变性、坏死、增生,汇管区大量炎性细胞浸润;④透射电镜观察超微结构:与A组相比,B组、C组胆管上皮细胞损伤较轻,线粒体不肿胀,微绒毛丰富,排列整齐,D组和E组可见胆管柱状上皮细胞明显肿胀变形,甚至导致胆管闭塞,胆管内微绒毛消失,线粒体空泡化,内质网扩张;⑤激光共聚焦双重免疫荧光检测:B、C组胆管损伤较轻,而D、E组可见胆管基底膜部分脱落,胆管损伤较重,周围肝细胞明显变性;⑥Western-blot检测:B组和C组HO—1、Mrp2、Bsep、Ntcp蛋白水平较A组、D组和E组升高更明显,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]1.构建了大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并成功转染至大鼠体内。2.成功建立“二袖套”法大鼠原位肝移植模型,并采用“支架法”重建肝动脉,使其更符合临床上肝移植的病理生理改变,保证了较高的移植大鼠术后存活率,证明我们所建立的大鼠原位肝移植模型是一种稳定、便于操作的模型,值得推广。3.在肝移植术前诱导大鼠体内HO-1高表达,能明显减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤,抑制HO-1的表达则会加重其损伤。4.优先处理供体,诱导供体HO-1的高表达比诱导受体HO-1的高表达对减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤的作用更明显,为临床上减轻和防治肝移植术后缺血型胆道病变提供新的思路和方法。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R657.3;R-332
【部分图文】：

图２?Ｎｏｒｗａｙ大鼠与ＳＤ大鼠序列对比??Ｆｉｇ２．Ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｒａｔｔｕｓ?ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ?ＨＯ－１?ＣＤＳ?ａｎｄ?ｒａｔｔｕｓ?ＳＤ?ＨＯ－１?ＣＤＳ??３．?ｆｆｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定Ａｄｖ—ｐＣＷ３１８在大鼠肝细胞内的表达??大鼠Ｈ０—１?—抗采用１?：?５００稀释倍数（图３）。Ａｄｖ－ｐＣＷ３１８原倍及稀释倍??数为１ＣＴ１倍经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测在３２ＫＤ附近处有特征条带，其大小和目的基??因融合蛋白相吻合，表明大鼠ＨＯ—１基因过表达腺病毒载体Ａｄｖ－ＨＯ－ｌ构建成功。??ＡＤＶ－ｆＨＭＯＸ１?２００?２０?〇??４３ｋ〇??ＨＭＯＸｌ＾?３２ｋＤ??

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【参考文献】

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本文编号：2887281