耻垢分枝杆菌整合宿主因子MsIHF的结构与功能研究

发布时间：2020-11-17 10:38

　　 拟核相关蛋白又称拟核结构蛋白、细菌染色质蛋白或DNA结合蛋白。拟核相关蛋白通过与DNA结合并使DNA弯折、桥连、或缠绕,在拟核结构的压缩和组织中起到了重要的作用,并影响着细菌染色体的复制,分离,修复和表达过程。结核分枝杆菌是导致结核病的致病菌,而耻垢分枝杆菌是实验室研究结核病常用的模式菌。分枝杆菌主要编码三种染色质蛋白,即mHU、Lsr2和整合宿主因子(mIHF),mIHF仅在放线菌中保守,但与其他细菌拟核相关蛋白的相似性很低。目前已经有报道证明mIHF对分枝杆菌的生存是必须的。经过序列比对,发现来自结核分枝杆菌的MtIHF和耻垢分枝杆菌的MsIHF同源性很高,C端序列的一致性接近100%,而生化实验表明去除N端后对蛋白功能没有影响。因此对MsIHF的研究有助于结核病新药的研发。在本研究中,我们构建了含有MsIHF目的基因的pET28at-plus质粒并转入E.coli表达菌株RosettaⅡ中,诱导MsIHF的大量表达,高压破碎细胞后,通过Ni柱亲和层析、离子交换层析、分子凝胶过滤层析的方法对蛋白进行纯化,得到纯度约95%以上的目的蛋白后进行晶体的初筛。设计合适的DNA长度与纯化好的蛋白进行孵育从而得到MsIHF-DNA复合物,对复合物初筛出晶体后通过调整沉淀剂浓度、pH、蛋白浓度、DNA长度以及种晶的方法进行晶体的优化,直到获得分辨率高的晶体,通过X-射线衍射进行数据的收集。我们解析了MsIHF与16 bpDNA的复合物晶体结构:在一个不对称单元中,两个MsIHF单体形成了一个二体,并结合了一条DNA双链。这两个MsIHF单体的结构几乎完全相同,都由五个α-螺旋组成。在MsIHF蛋白质二聚体的两侧形成了较大的正电区域。不同于大肠杆菌中的异源二聚体IHF,可以诱导DNA形成一个U型弯折,而MsIHF仅仅使DNA的构象发生了轻微的改变。单个氨基酸的突变和MsIHF-DNA相互作用分析证明两个正电荷表面都可以结合DNA,这表明了MsIHF可以桥连不同的DNA分子,或者稳定DNA的弯折。我们通过分析超速离心实验、化学交联实验证明了MsIHF在溶液中以二聚体形式存在,与解析的结构信息一致。MsIHF在放线菌中具有高度的保守性,揭示放线菌中的IHF通过一个新的DNA相互作用机制发挥其功能,为mIHF作为结核病药物设计的潜在靶标提供一定的理论基础。
【学位单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R378.911
【部分图文】：

着细菌中这些蛋白被揭示出越来越明确的属性后，这个命名就显得不太。它们现在统称为拟核相关蛋白（ＮＡＰｓ），可以在没有暗示它们在结构上与有任何相似性的情况下，更精确的反映它们在细胞中的位置。??拟核相关蛋白（ＮＡＰｓ）是一类小的，能够大量表达的蛋白，通过与ＤＮＡ使ＤＮＡ弯折、桥连、或缠绕，从而在细菌染色体的组织，分离，复制，过程中都起到了重要作用。一些拟核相关蛋白能够在特定启动子处调节转始，并且与转录因子能够调节基因表达的方式相一致，细菌生长阶段不同蛋白的表达量和功能都有一定的影响。某些蛋白在指数生长期是不存在的，稳定期是大量存在的，反过来也一样［３，４］。在转录过程中，由于一些ＮＡＰｓ了全局性的调控作用，缺失后可能会导致多效性的表型变化［５—７］。??目前在大肠杆菌中至少有１２种不同的拟核相关蛋白被鉴定出来，其中ＩＨＦ，Ｈ－ＮＳ以及Ｆｉｓ被研究的最为透彻［５，６，８］。如下图所示，大肠杆菌几种拟蛋白通过桥连、缠绕和弯折等不同的方式在染色体组织中起到了重要的作

＞?ｓ?＾??图１．２几种拟核相关蛋白对ＤＮＡ进行桥连、缠绕和弯折Ｍ??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｎｕｃｌｅｏｉｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｗｉｔｈ?ＤＮＡ?ｂｒｉｄｇｉｎｇ，?ｗｒａｐｐｉｎｇ?ｏｒ?ｂｅｎｄｉｎｇ??２??

它作为拟核相关蛋白在细菌的ＤＮＡ压缩以及作用。它可以与很多靶标ＤＮＡ结合，并且以在大肠杆菌中转录因子一样而被熟知［２９］。它主要的功能是使靶标ＤＮＡ弯ＡＰｓ和转录因子协同作用＠１。??一个小的，热稳定的蛋白，能够结合位于富含ＡＴ的核心保守序聚体有功能活性的的亚基包括ＩＨＦａ?（１１．１Ｋ）和ＩＨＦＰ?（１０．７Ｋ基因所编码，分别是和／Ａ／Ｓ［２７Ｉ。与ＨＵ蛋白的结构具有较体都是由三个ａ螺旋形成中心体，两个反向平行的ｐ带形成两的尖端都含有一个可以插入ＤＮＡ碱基之间的脯氨酸（黄色），的堆积作用，导致ＤＮＡ小沟扩大，形成剧烈的扭结，发生Ｕ染色体上已经鉴定出大约１０００个左右特异的ＩＨＦ结合位点。动子附近并且可能参与转录激活［３３，３４］。??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 何子纯;李升锦;;流式细胞术检测胞内重组耻垢分枝杆菌的活力研究[J];中国微生态学杂志;2011年08期

2 吴雯;张红宇;黄汉菊;范兴;罗道泉;吴少庭;;重组耻垢分枝杆菌Msmc~2-CFP10-ESAT6的构建[J];中国病原生物学杂志;2009年03期

3 徐永柱;吕琳;;耻垢分枝杆菌疫苗经灌胃免疫在小鼠体内的分布与安全性研究[J];第三军医大学学报;2009年09期

4 杨春;王渝伟;伊正君;何永林;李娜;徐蕾;张黎;朱道银;;颗粒溶素和白细胞介素12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用[J];中华结核和呼吸杂志;2007年02期

5 李仲兴;;耻垢分枝杆菌群感染及其菌种鉴定[J];中华检验医学杂志;2006年05期

6 徐苗,陈保文,沈小兵,苏城,罗永艾,王国治;耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年09期

7 胡亚文;白嘉诚;葛文雪;姚梦依;张雪莲;;耻垢分枝杆菌中反式翻译报告体系的构建[J];微生物与感染;2019年01期

8 姚建忠,许崇波,刘齐贵,靳风烁;表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立[J];第三军医大学学报;2005年07期

9 杨春;徐蕾;伊正君;何永林;李娜;王渝伟;张黎;朱道银;;重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价[J];免疫学杂志;2007年04期

10 程继忠,郑波,肖红梁,驹卿,皇甫永穆;结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;1998年05期

相关博士学位论文 前10条

1 黄凤;结核分枝杆菌的细胞生长调控机制研究[D];华中农业大学;2012年

2 李启明;结核分枝杆菌耐药基因的鉴定及耐药分子机理的研究[D];西南大学;2018年

3 肖婧;CRISPR干扰系统的建立及其在分枝杆菌重要基因功能研究中的应用[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2018年

4 史丽滨;耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）EmbC蛋白C端的功能探讨[D];大连医科大学;2005年

5 伊正君;靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗的实验研究[D];重庆医科大学;2006年

6 向廷秀;幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及作用机理研究[D];重庆医科大学;2006年

7 杨春;GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用[D];重庆医科大学;2007年

8 商正玲;结核Rv1246c-Rv1247c基因重组耻垢分枝杆菌及其编码蛋白功能的初步研究[D];四川大学;2007年

9 刘慧聪;两个TetR家族的转录因子介导耻垢分枝杆菌药物抗性调控的分子机制研究[D];华中农业大学;2016年

10 曹俊;结核分枝杆菌脂肪酶的功能研究[D];中国农业科学院;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 吴蕊鑫;Coronin-1siRNA在巨噬细胞中的特异性表达及抗耻垢分枝杆菌感染的实验研究[D];重庆医科大学;2018年

2 常芳倩;耻垢分枝杆菌整合宿主因子MsIHF的结构与功能研究[D];安徽大学;2019年

3 何黎;细粒棘球绦虫EgM123重组耻垢分枝杆菌构建及其免疫原性研究[D];新疆医科大学;2019年

4 梁思佳;肠道病毒71型疫苗的交叉保护作用及其基因重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建[D];桂林医学院;2018年

5 郭殊瑾;耻垢分枝杆菌mc~2155中rpfA基因转录调控机制的研究[D];华中农业大学;2016年

6 梁大航;基于弓形虫ROP18的重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定[D];蚌埠医学院;2013年

7 郑慧敏;低频低强度超声介导质粒转入大肠杆菌及耻垢分枝杆菌的实验研究[D];重庆医科大学;2017年

8 曹俊;耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌抗原的交叉免疫反应研究[D];重庆医科大学;2017年

9 赵善民;重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答、保护力及对感染小鼠的免疫治疗作用[D];第四军医大学;2012年

10 周思;耻垢分枝杆菌中一个新型c-di-GMP响应的转录因子及其调控功能研究[D];华中农业大学;2017年

本文编号：2887404