泛素连接酶NEDD4调节细胞自噬的机理研究

发布时间：2020-11-17 19:38

　　 背景:自噬(autophagy)是一种由营养饥饿、内质网(ER)应激、自由基氧化应激等信号引起的溶酶体介导的降解过程,其在细胞能量代谢、应激反应、细胞生存等过程中起至关重要的调控作用。自噬过程异常与多种疾病直接相关,研究自噬过程的分子机理及其调节信号通路,可能促进发现疾病治疗的新方法和新靶点。早期的研究认为自噬对底物没有选择性。近年来研究发现很多自噬过程,如损坏的线粒体、过氧化物体等细胞器以及变性蛋白聚集物的自噬清除,自噬底物首先经过泛素化标记,然后由自噬受体(autophagy receptor)识别结合泛素化的底物并通过自噬体蛋白LC3将自噬底物连接到自噬前体(phagophore),形成自噬体(autophagosomes)后运送到溶酶体进行降解。这一类由自噬受体选择识别泛素化自噬底物的自噬过程称为选择性自噬(selective autophagy)。目前,针对泛素化对自噬过程调节的研究主要集中在选择性自噬底物的调控上,而对自噬蛋白本身以及选择性自噬的启动、活化和自噬体形成的调控等方面的研究则相对较少。因此,深入研究泛素化对自噬蛋白及自噬受体的调控作用,对于理解选择性自噬的调节机制具有较大的理论意义。NEDD4(又称NEDD4-1)是属于HECT家族的泛素连接酶,最初是在小鼠神经元前体细胞中被发现的,其在多种肿瘤组织高度表达。在筛选NEDD4的泛素化底物时发现NEDD4倾向于泛素化酪氨酸激酶及内吞体转运分类蛋白,其通过泛素化不同的底物参与调控离子通道的活性、膜受体的内吞、病毒出芽以及神经元发育等生理过程。目前已有个别研究表明,NEDD4可能在自噬过程中起着重要作用,但其对自噬的调节过程及机制并不清楚。通过序列分析发现,NEDD4含有4个潜在的WXXL/I,提示NEDD4很可能与LC3相互作用并参与自噬特别是选择性自噬的泛素化调节。因而进一步研究泛素连接酶NEDD4在自噬泛素化调节中的作用,对于理解选择性自噬的泛素化调节机理,具有重要的理论意义。研究目的:本文旨在研究泛素连接酶NEDD4与自噬体蛋白LC3及自噬受体SQSTM1之间的关系,深入探讨NEDD4介导的自噬受体SQSTM1泛素化信号在选择性自噬过程中的作用及其机制,为选择性自噬的泛素化调节提供新的理论依据,为自噬相关疾病的临床治疗提供新的方向和思路。研究方法:1.细胞培养和处理HEK293T,HEK293A,A549,HepG2和BE(2)-C cells均购于ATCC。细胞以含有1%penicillin/streptomycin和10%FBS的DMEM培养基在37℃、5%CO_2条件下培养。根据不同实验要求,细胞给予饥饿或1uM Rapamycin处理18h以激活自噬,或者溶酶体抑制剂Chloroquine(50uM)处理18h。在SQSTM1和NBR1泛素化分析相关试验中,细胞使用10uM MG132或10uM Bortezomib预处理18h以抑制蛋白降解。2.蛋白质免疫印迹技术(Western blot)通过Western blot技术对相应蛋白指标NEDD4,LC3,SQSTM1,BECN1,PDCD6IP及NBR1在细胞中进行半定量。3.免疫共沉淀(CO-IP)和GST-LC3B pulldown实验使用CO-IP和GST-LC3B pulldown技术获得与NEDD4蛋白相结合的蛋白质,通过Western blot检测NEDD4与相应蛋白结合情况。4.慢病毒载体表达系统通过PCR以及分子克隆技术构建pLKO.1-shNEDD4和pFUW-HA-NEDD4-q(the shRNA-resistant NEDD4)慢病毒载体用以分别沉默、恢复表达NEDD4。过表达pLVTHM-GFP-LC3和pLVTHM-GFP-SQSTM1用来示踪自噬。5.透射电子显微镜技术(TEM)采用TEM观察对照组和NEDD4 shRNA组细胞中自噬体和自噬溶酶体形成的变化,评价敲低NEDD4对自噬的影响。6.细胞免疫荧光利用免疫荧光标记技术观察细胞自噬过程、亚细胞蛋白定位以及膜泡转运过程。7.Cyto-ID自噬检测试剂盒染色选用Cyto-ID自噬检测试剂盒使活细胞中的自噬体携带标记,在共聚焦显微镜下跟踪活细胞中标记的自噬体,动态观察自噬过程,并定量分析自噬过程。8.泛素化蛋白检测采用CO-IP结合Western blot技术和GST-Uba pulldown结合Western blot技术检测泛素化蛋白。首先用一抗IP再进行SDS-PAGE电泳孵育anti-Ub抗体检测泛素化蛋白,或者先采用GST-Uba亲和沉淀再进行SDS-PAGE电泳孵育anti-SQSTM1抗体检测泛素化蛋白。9.离体E3泛素连接酶活性测定在HEK293T细胞里过表达NEDD4,通过免疫沉淀分离NEDD4,将免疫沉淀的NEDD4与不同量的纯化LC3B蛋白在冰上共同孵育;然后添加单体泛素到反应混合物中启动泛素连接反应;最后进行SDS-PAGE电泳分离多聚泛素,通过anti-Ub抗体检测由单泛素缀合的多聚泛素产物,以评估NEDD4的连接酶活性。研究结果:1.免疫共沉淀和GST-LC3B pulldown结果表明NEDD4能与自噬体蛋白LC3相互作用,并鉴定出NEDD4中的LIR2结构域是与LC3结合的位点。2.NEDD4敲低导致严重的自噬缺陷,引起SQSTM1蛋白累积,并阻断Rapamycin或饥饿诱导的自噬激活。3.NEDD4敲低诱导LC3阳性自噬前体和自噬体变形和聚集,并且NEDD4敲低诱导聚集的GFP-LC3B斑点与ER膜标志物共定位。4.电子显微镜观察到敲低NEDD4导致肺癌A549细胞中的线粒体变形,提示NEDD4可能在线粒体自噬中发挥一定作用。5.LC3不是NEDD4的泛素化底物,而是NEDD4的活化蛋白。6.NEDD4通过其HECT结构域直接与自噬受体SQSTM1的PB1结构域相互作用并使其发生泛素化,NEDD4对SQSTM1的泛素化是在PB1结构域上通过K63位交联形成的,此泛素化并不涉及到蛋白酶体介导的降解;而另一自噬受体NBR1既不是NEDD4的结合蛋白也不是NEDD4的泛素化底物。7.敲低NEDD4或过表达NEDD4连接酶失活突变体(NEDD4-LD)引起包涵体自噬缺陷,导致异常增大的SQSTM1阳性包涵体聚集,并且与ER标记物CANX共定位。研究结论:自噬体蛋白LC3与NEDD4结合并激活NEDD4的连接酶活性,可能促进NEDD4与自噬受体SQSTM1特异结合并泛素化SQSTM1,并且该泛素化信号调控SQSTM1介导的包涵体自噬。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R363
【部分图文】：

细胞自噬类型[21]

图 1.2 自噬受体蛋白结构[100]Figure 1.2 Domain structures of autophagy receptor proteins.1.5.1 SQSTM1 蛋白p62/SQSTM1（以下简称 SQSTM1），是第一个被鉴定出来的自噬受体蛋01]。SQSTM1 是一种细胞内蛋白[102]，最初被鉴定为 p56lck SH 结构域的磷酸酸非依赖性配体[103]。Shin 首先克隆出 p62，并在后续研究中发现 p62 具有蛋白聚集体的能力，据此 Shin 将 p62 命名为 sequestosome 1 (SQSTM1) [104]后，其在小鼠、大鼠以及果蝇中的同源物分别命名为A170、ZIP和Ref(2)P[105-1鼠 A170，与人 SQSTM1 同源，最初在巨噬细胞中被认为是应激诱导的细胞白[108]。目前，SQSTM1 被认为是一种多功能蛋白[102]，人类 SQSTM1 由 4氨基酸组成，具有多个功能结构域：氨基末端 PB1 结构域，主要负责自身

图 1.3 自噬相关的人类疾病[130]Figure 1.3 Autophagy-related human diseases1.2 泛素化及泛素连接酶 NEDD41.2.1 泛素化反应翻译后修饰（post-translational modification, PTM）是蛋白质结构和功能多样化的基本机制，控制基因组中几乎所有蛋白编码基因的活性。在各种 PTM 类型中，泛素化，可共价结合 76 个氨基酸组成的小分子多肽泛素（ubiquitin, Ub），在蛋白酶体和溶酶体介导的蛋白降解、膜受体内吞、基因转录以及细胞自噬中至关重要。泛素化是细胞信号转导的一条主要途径，通过泛素蛋白酶体系统 UPS控制蛋白质降解。泛素化是一种高度有序的三级联酶促过程：活化、交联和连接。
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本文编号：2887843