基于FSHR表位肽的纳米避孕疫苗的构建及其体内外效应研究

发布时间：2020-11-19 16:07

　　 随着社会和经济的发展,男性参与家庭计划的意愿也日趋强烈,但可供选择的避孕措施十分局限。免疫避孕疫苗具有多重优点,被认为在男性避孕中将是最具前景的措施之一。促卵泡生成素/促卵泡生成素受体(Follicle stimulating hormone/Follicle stimulating hormone receptor;FSH/FSHR)信号参与调节启动精子发生和维持精子正常生成,是男性生殖中的重要环节;而且在男性FSHR仅表达于睾丸支持细胞,因此FSHR被选择成为避孕研究的靶标之一。近期,基于FSHR避孕疫苗的研究获得了令人欣喜的成果,利用计算机表位预测技术筛选出的FSHR32-44肽段,经体内验证成功避免了以往FSHR疫苗对生殖器官损伤的副作用,并能诱导生育抑制的作用。但仍有一些局限性,尚不能应用于临床,如FSHR表位疫苗免疫原性差,诱导的抗体滴度低;联合使用的氟氏佐剂存在安全性问题;融合多肽载体引起免疫偏移诱导免疫损伤风险。基于纳米载体的递送系统具有安全、高效、靶向和副作用小的特点,在药物递送和肿瘤疫苗中已显示出独特优势。因此,为解决表位疫苗存在的上述问题,本研究拟设计并构建FSHR优势表位纳米疫苗。本研究以前期实验中筛选的FSHR无病理损害优势表位为基础,使用p H敏感材料缩醛化β-环糊精(Acetalatedβetalated trin,Ac-bCD)和非敏感性材料聚(乳酸-羟基乙酸)(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)为载体,设计构建具有不同p H特性的表位肽纳米避孕疫苗(FSHR/Ac-b CD NP和FSHR/PLGA NP),分别通过体外实验和体内实验研究纳米疫苗的免疫效应和抗生育作用。课题研究分为以下三个部分。一、不同pH响应性的FSHR纳米疫苗的制备及其表征以本实验室前期研究工作中筛选的FSHR优势抗原表位(IELRFVLTKLRVI)为靶抗原,采用固相合成技术,人工合成高纯度的FSHR32-44肽段,分别使用Ac-b CD和PLGA材料作为载体,通过乳化法制备了FSHR纳米疫苗。结果显示,采用固相合成法获得的FSHR肽纯度大于95%,两种材料均能成功包载多肽,形成粒径200 nm左右的纳米粒,包封率60%以上。透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)和扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)观察表明纳米粒形态规整、粒径分布均匀,体外水解和释放实验均证实fshr/ac-bcdnp有在ph5.0的溶液中快速水解的特点,可释放出fshr多肽,而在ph7.4的溶液中和plganp一样呈缓释特征。二、fshr表位纳米疫苗的体外免疫效应使用骨髓来源诱导培养的未成熟树突状细胞(immaturedendriticcells,idcs)进行体外评价。用不同剂型的fshr多肽抗原刺激idcs,利用激光共聚焦和流式细胞技术观察树突状细胞(dendriticcells,dcs)对抗原的吞噬能力和特点;并观察不同抗原刺激后dcs的表型分子变化,以及诱导t淋巴细胞增殖和分泌因子的能力。结果表明,通过细胞因子诱导,可以获得80%以上cd11c+的功能健全的idc;纳米化抗原利于idc吞噬,提高了抗原的摄取量,具有时间和剂量依赖特征;fshr/plganp能有效刺激dcs,提高表面分子cd40、cd80、cd86和mhc-ii的表达量;摄取了纳米抗原的dcs能有效刺激t淋巴细胞增殖,并大量分泌炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)和γ-干扰素(interferon-γ,ifn-γ),其中ac-bcd和plga材料组无明显差异。三、不同ph响应性的fshr纳米疫苗的体内效应研究选择c57bl/6j雄性成年小鼠作为免疫对象,具体分组包括pbs(phosphatebuffersolution,磷酸盐缓冲液)、fshr、fshr/cfa、fshr/ac-bcdnp和fshr/plganp组;采用足垫皮内和皮下多点、多次免疫的方法。通过眼眶采血,elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附实验)法检测免疫前、后血清抗体滴度和睾酮水平变化;合笼观察雌鼠受孕率及产仔率评价对应组别雄鼠生育抑制程度,检测分析附睾精子质量;检查抗体水平下降后小鼠重要脏器和生殖器官的病理学变化,并利用硝酸镧示踪结合tem观察血睾屏障完整性。该部分研究结果显示fshr/cfa、fshr/ac-bcdnp和fshr/plganp组均可以诱导特异性抗体产生,纳米组抗体水平高于氟氏佐剂组,于初免后9周达高峰,其中plga组抗体水平最高达1:3200。生育抑制实验和精子质量分析均同抗体水平结果相似,有抗体产生的3组均有明显生育抑制作用,以plga组生育力最低为25%;抗体滴度越高总精子数越少、精子活力越下降,畸形精子百分比越上升。检测发现免疫前后各组间小鼠血清睾酮水平无变化,重要脏器肝、脾、肾和生殖器官睾丸、附睾的苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,he染色)也未见明显病理学变化。tem观察硝酸镧仅沉积于支持细胞紧密连接之外,未向曲细精管内部渗透,提示血睾屏障完整功能健全。由此可以得出结论,本研究构建的纳米材料可以作为避孕疫苗的载体,具有良好的生物相容性和佐剂作用,且无明显的毒副作用,将纳米疫苗靶向树突状细胞是提高免疫效果的有效途径。不过,p H敏感性Ac-b CD材料在提高免疫应答能力上,并未显示出优于非p H敏感性PLGA材料的作用。这为我们将来优化纳米疫苗的设计提供了基础研究支持。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R392
【文章目录】：
英文缩写词表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
    1.1 选题缘由
    1.2 研究背景
    1.3 研究意义
    1.4 研究内容
    1.5 研究方法
第二章 不同pH响应性的FSHR纳米避孕疫苗的设计、制备及其表征
    2.1 材料与方法
    2.2 结果
    2.3 讨论
第三章 不同pH响应性的FSHR纳米避孕疫苗的体外免疫效应的研究
    3.1 材料与方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
第四章 不同pH响应性的FSHR纳米避孕疫苗的体内活性评价
    4.1 材料与方法
    4.2 结果
    4.3 讨论
全文总结
参考文献
文献综述 免疫避孕疫苗的最新研究进展
    参考文献
硕士期间发表论文的情况
致谢

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本文编号：2890204