基于MDCK细胞悬浮培养扩增H9N2流感病毒的维持培养基开发及应用
发布时间：2020-12-06 22:58
禽流感大爆发严重威胁养殖业和人类健康,并给社会带来巨大的经济损失,而接种禽流感疫苗是目前主要的预防措施。无血清单细胞悬浮培养因其易于放大、工艺稳定、过程可控等优势,正成为流感疫苗生产的主流技术。面对禽流感疫苗市场供不应求的现状,如何应用无血清单细胞悬浮培养技术提高禽流感病毒产量的研究工作尤为重要。其中,无血清培养基是影响流感病毒生产最关键的因素之一。但当下无血清培养基多依赖国外进口,其价格昂贵、配方保密、不利于过程优化。此外,病毒生产特性不同于细胞生长,而在研究或工业生产中,病毒生产阶段所用维持培养基大多与细胞生长培养基是同一种,这种营养组分的不平衡限制了流感病毒的高效扩增。因此,迫切需要针对病毒生产阶段开发适于流感病毒生产的维持培养基。本文以MDCK细胞和H9N2禽流感病毒为研究对象,首先基于现有的MDCK细胞悬浮培养工艺,连续运用Simplex Lattice、Placektt-Burman和中心组合实验设计三种统计学方法,开发了一种支持H9N2流感病毒在MDCK悬浮细胞中高效扩增的Opt-MM培养基。接着,在摇瓶体系中对稀释接毒工艺进行优化,优化后最优稀释比例为1:1;在2L生物...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 禽流感及禽流感疫苗
1.1.1 禽流感
1.1.2 禽流感病毒
1.1.3 禽流感疫苗
1.2 禽流感疫苗动物细胞培养工艺
1.2.1 动物细胞培养技术的发展
1.2.2 MDCK细胞及其生产流感疫苗的方式
1.2.3 MDCK细胞无血清培养基的研究进展
1.3 流感病毒维持培养基的开发
1.3.1 细胞生长培养基与维持培养基
1.3.2 影响流感病毒生产的重要添加物
1.3.3 无血清培养基的开发方法
1.4 本文的研究内容、目的及意义
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株
2.1.2 流感病毒株
2.1.3 培养基
2.1.4 实验材料及仪器
2.2 实验方法
2.2.1 贴壁MDCK细胞复苏与传代培养
2.2.2 悬浮MDCK细胞复苏与传代培养
2.2.3 病毒感染
2.3 分析方法
2.3.1 细胞计数
2.3.2 流感病毒HA滴度的测定
50的测定"> 2.3.3 流感病毒TCID50的测定
2.3.4 细胞代谢物浓度的测定
2.4 数据处理
2.4.1 细胞比生长速率的计算
2.4.2 MOI的计算
2.4.3 单细胞产毒率的计算
2.4.4 代谢物比消耗或比生成速率的计算
2.4.5 统计学分析
第3章 维持培养基的开发与优化
3.1 前言
3.2 实验方案
3.3 结果与讨论
3.3.1 Simplex Lattice实验设计筛选维持培养基基本组成
3.3.2 Placektt-Burman实验设计筛选促进流感病毒生产的显著添加物
3.3.3 中心组合设计优化促进病毒生产的显著添加物浓度
3.4 本章小结
第4章 维持培养基在生物反应器中的验证及细胞代谢研究
4.1 引言
4.2 实验方案
4.3 结果与讨论
4.3.1 接毒稀释流加工艺优化
4.3.2 2L生物反应器验证
4.3.3 细胞代谢特性研究
4.4 本章小结
第5章 维持培养基的应用初探
5.1 前言
5.2 实验方案
5.3 结果与讨论
5.3.1 维持培养基在不同种类胰酶条件下的应用
5.3.2 维持培养基在不同种类毒株条件下的应用
5.3.3 维持培养基在MDCK细胞传代方面的应用
5.4 本章小结
第6章 全文总结与展望
6.1 全文总结
6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间撰写的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]D型流感病毒研究进展[J]. 高晓龙,韦海涛,宋彦军,王跃,殷雨晴,王林,梅力,冯小宇. 畜牧兽医学报. 2018(07)
[2]TPCK胰酶和普通胰酶对各亚型流感病毒在MDCK细胞分离培养中的影响[J]. 马萍,李欣玥. 中国卫生检验杂志. 2017(18)
[3]基于MDCK悬浮细胞生产禽流感疫苗的放大工艺开发[J]. 代为俊,刘旭平,周燕. 中国兽药杂志. 2017(08)
[4]禽流感疫苗研究进展[J]. 周虹妤,裴磊,冯嘉林,盛瑜. 中国畜牧兽医文摘. 2016(08)
[5]我国H9N2亚型禽流感流行病学特点及流行现状[J]. 吕雪峰,任锐,钟雯,李昱洁,程荣华,邵洪泽,黄海楠. 兽医导刊. 2016(09)
[6]MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增殖上的初步应用[J]. 冯磊,吴培培,褚轩,王伟峰,陈丽,侯继波. 浙江农业学报. 2015(06)
[7]Vero细胞无血清培养基的优化[J]. 段盼盼,杨帆,耿兴良,龙云凤,郭琦,龙艺,王明清,廖国阳,李卫东. 中国生物制品学杂志. 2015(05)
[8]细胞密度和营养供给对H1N1流感病毒产率的影响[J]. 孔文刚,黄锭,罗剑,周琳婷,陈则,刘旭平,谭文松,邓献存. 生物技术通报. 2015(01)
[9]微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究[J]. 李春艳,肖晶,李曦,刘娣. 中国人兽共患病学报. 2009(12)
[10]低浓度金属离子体外抗病毒研究[J]. 侯欣彤,徐斌斌,刘艳,田晓乐,张益波,孟庆繁. 食品工业科技. 2007(06)
博士论文
[1]基于MDCK细胞高密度培养的甲型流感病毒疫苗生产工艺开发与优化[D]. 黄锭.华东理工大学 2016
硕士论文
[1]无血清悬浮培养MDCK细胞生产H9亚型禽流感疫苗的关键控制点探究[D]. 彭雯娟.华东理工大学 2017
本文编号：2902142
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 禽流感及禽流感疫苗
1.1.1 禽流感
1.1.2 禽流感病毒
1.1.3 禽流感疫苗
1.2 禽流感疫苗动物细胞培养工艺
1.2.1 动物细胞培养技术的发展
1.2.2 MDCK细胞及其生产流感疫苗的方式
1.2.3 MDCK细胞无血清培养基的研究进展
1.3 流感病毒维持培养基的开发
1.3.1 细胞生长培养基与维持培养基
1.3.2 影响流感病毒生产的重要添加物
1.3.3 无血清培养基的开发方法
1.4 本文的研究内容、目的及意义
第2章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株
2.1.2 流感病毒株
2.1.3 培养基
2.1.4 实验材料及仪器
2.2 实验方法
2.2.1 贴壁MDCK细胞复苏与传代培养
2.2.2 悬浮MDCK细胞复苏与传代培养
2.2.3 病毒感染
2.3 分析方法
2.3.1 细胞计数
2.3.2 流感病毒HA滴度的测定
50的测定"> 2.3.3 流感病毒TCID50的测定
2.3.4 细胞代谢物浓度的测定
2.4 数据处理
2.4.1 细胞比生长速率的计算
2.4.2 MOI的计算
2.4.3 单细胞产毒率的计算
2.4.4 代谢物比消耗或比生成速率的计算
2.4.5 统计学分析
第3章 维持培养基的开发与优化
3.1 前言
3.2 实验方案
3.3 结果与讨论
3.3.1 Simplex Lattice实验设计筛选维持培养基基本组成
3.3.2 Placektt-Burman实验设计筛选促进流感病毒生产的显著添加物
3.3.3 中心组合设计优化促进病毒生产的显著添加物浓度
3.4 本章小结
第4章 维持培养基在生物反应器中的验证及细胞代谢研究
4.1 引言
4.2 实验方案
4.3 结果与讨论
4.3.1 接毒稀释流加工艺优化
4.3.2 2L生物反应器验证
4.3.3 细胞代谢特性研究
4.4 本章小结
第5章 维持培养基的应用初探
5.1 前言
5.2 实验方案
5.3 结果与讨论
5.3.1 维持培养基在不同种类胰酶条件下的应用
5.3.2 维持培养基在不同种类毒株条件下的应用
5.3.3 维持培养基在MDCK细胞传代方面的应用
5.4 本章小结
第6章 全文总结与展望
6.1 全文总结
6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间撰写的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]D型流感病毒研究进展[J]. 高晓龙,韦海涛,宋彦军,王跃,殷雨晴,王林,梅力,冯小宇. 畜牧兽医学报. 2018(07)
[2]TPCK胰酶和普通胰酶对各亚型流感病毒在MDCK细胞分离培养中的影响[J]. 马萍,李欣玥. 中国卫生检验杂志. 2017(18)
[3]基于MDCK悬浮细胞生产禽流感疫苗的放大工艺开发[J]. 代为俊,刘旭平,周燕. 中国兽药杂志. 2017(08)
[4]禽流感疫苗研究进展[J]. 周虹妤,裴磊,冯嘉林,盛瑜. 中国畜牧兽医文摘. 2016(08)
[5]我国H9N2亚型禽流感流行病学特点及流行现状[J]. 吕雪峰,任锐,钟雯,李昱洁,程荣华,邵洪泽,黄海楠. 兽医导刊. 2016(09)
[6]MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增殖上的初步应用[J]. 冯磊,吴培培,褚轩,王伟峰,陈丽,侯继波. 浙江农业学报. 2015(06)
[7]Vero细胞无血清培养基的优化[J]. 段盼盼,杨帆,耿兴良,龙云凤,郭琦,龙艺,王明清,廖国阳,李卫东. 中国生物制品学杂志. 2015(05)
[8]细胞密度和营养供给对H1N1流感病毒产率的影响[J]. 孔文刚,黄锭,罗剑,周琳婷,陈则,刘旭平,谭文松,邓献存. 生物技术通报. 2015(01)
[9]微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究[J]. 李春艳,肖晶,李曦,刘娣. 中国人兽共患病学报. 2009(12)
[10]低浓度金属离子体外抗病毒研究[J]. 侯欣彤,徐斌斌,刘艳,田晓乐,张益波,孟庆繁. 食品工业科技. 2007(06)
博士论文
[1]基于MDCK细胞高密度培养的甲型流感病毒疫苗生产工艺开发与优化[D]. 黄锭.华东理工大学 2016
硕士论文
[1]无血清悬浮培养MDCK细胞生产H9亚型禽流感疫苗的关键控制点探究[D]. 彭雯娟.华东理工大学 2017
本文编号：2902142
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