基于CRISPR-Cas12a和λ Red重组酶体系的质粒编辑系统的构建及其应用

发布时间：2020-12-09 20:08

　　质粒是研究细菌、病毒和真核生物细胞内遗传信息和通路异质性表达的有用工具。随着分子生物学技术日益发展,已经有许多方法可用于体外、体内质粒克隆（如酶切酶连、PCR、体外重组以及体内重组等）,甚至大片段克隆也不再是难题。常用的酶切法受限于酶切位点的存在与否及唯一性,添加酶切位点会引入的额外序列与DNA序列复杂性（如DNA片段过大、序列碱基分布及含量等）相关的扩增困难,以及应用于构建质粒文库时的操作复杂、耗时长。重组技术一定程度上解决上述问题。重组技术是一种基于核酸同源重组原理,利用噬菌体重组蛋白促进寡核苷酸或线性DNA介导的体内同源重组技术,已广泛应用于质粒、细菌人工染色体质粒和多种原核生物基因组DNA的改造,包括碱基突变、缺失或插入。鉴于其重组效率相对较低,需要添加筛选标记（如抗生素）来增加重组效率,而后去掉筛选标记则需利用两步法或引入序列特异性重组酶切除抗性标签（抗性基因两边有同向的两个短的DNA序列可以被特定的重组酶识别）,切除后仍会留下一个短的能够被重组酶识别的DNA序列,这种重组操作更复杂且耗时长,很难得到一个真正的无痕突变株。此外,重组质粒形成多聚体形式或是同一细胞内重组质粒与亲... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

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【部分图文】：

图１重组的模型图［６］??

意思的发现是ＣＲＩＳＰＲ序列中许多间隔序列是来源于质粒和发现ＣＲＩＳＰＲ位点是可以转录的［２７］，而且推测ｃａｓ基因编码酶结构域［２４，２６，２８，２９］，所以综合起来推测〇１１３？１＾３８是一个ＲＮＡｓ是侵染的记忆标记２００７年，乳酸杆菌与嗜热链球首次提供了?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ介导适应性免疫实验证据［３１］，这个法就是在牛奶工业生产过程中培养的细菌中含有的天然ＣＲＩ抵御噬菌体的感染，这是一个成功应用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ于生物０８年，有研究报道在大肠杆菌中，具有导向作用的成熟Ｃ）与Ｃａｓ蛋白形成复合物干扰病毒的增殖Ｐｌ，同一年，在病道了?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统靶向ＤＮＡ的活性［３４］，后来研究确定重复序列（ＣＲＩＳＰＲ，Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ?Ｒｅｇｕｌａｒ丨ｙ?Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ?Ｓｈｏｒｔ和ＣＲＩＳＰＲ相关蛋白是大多数细菌及古细菌中的一种获得性来核酸例如来自噬菌体ＤＮＡ或ＲＮＡ，质粒和其它外源ＤＮ的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统具有共同的特性，如重复间隔序列，这是Ｃａｓ核酸酶剪切外来核酸的相关特性［３５，３６］。??Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ??

图３?ＣＲＩＳＰＲ的分类分型［４０，４１］??４?ＣＲＩＳＰＲ的作用机制??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫系统的作用机制主要包括三步，ＤＮＡ的编码，ＲＮＡ的导向靶向ＤＮＡ。第一步就是间隔序列的获取，Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２将外源入侵的核酸序列整到ＣＲＩＳＰＲ序列的５’端中也就是邻近前导序列成为新的间隔序列；第二步是ＣＲＩＳＰ序列表达产生成熟前体ＣＲＩＳＰＲ?ＲＮＡ?（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），它是一个单链的ＲＮＡ分子含所有的重复间隔序列。Ｉ型系统Ｃａｓ６处理加工Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ?（Ｉ－Ｃ型是由Ｃａｓ５加处理），在ＩＩ型系统中是由ＲＮａｓｅ?ＩＩＩ和Ｃａｓ９加工处理，使ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ成为成熟ｃｒＲＮＡ?（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）；最后一步是干扰与间隔序列互补的入侵核酸。在Ｉ型系中，ｃｒＲＮＡ与Ｃａｓｃａｄｅ复合物相互作用产生效应复合物依赖间隔序列与促间隔序之间的互补性识别和结合外源入侵的双链ＤＮＡ，并招募Ｃａｓ３来切割靶向ｄｓＤＮｃｒＲＮＡ与互补耙向ＤＮＡ链之间的碱基配对将导致非耙向ＤＮＡ链Ｒ?ｌｏｏｐ的形成然后Ｃａｓ３的核酸外切酶活性在促间隔序列之内切割非靶向链并以一种依赖铁


本文编号：2907415