艰难梭菌基因编辑技术研究进展
发布时间：2020-12-25 03:05
艰难梭菌Clostridioesdifficile是一种革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧细菌,是医院相关性腹泻的主要病原体。近年来,随着强毒株的出现(如核糖体027型),其流行性与致死率逐年上升,因此对艰难梭菌生理、生化特征及致病机制的研究受到广泛重视。艰难梭菌生理、生化特征及致病机制研究又以建立其稳定、高效的基因编辑方法为必要前提。借助基因编辑工具,研究者可以扰动艰难梭菌核心生物学过程,在分子水平研究其分子致病机制。如Clos Tron技术在艰难梭菌毒素A (Toxin A)和毒素B (Toxin B)与其致病力关系的研究中起到了关键作用。文中以时间为主线综述了艰难梭菌基因编辑技术的发展历程和最新进展,并对艰难梭菌基因编辑技术未来的研究方向进行展望。
【文章来源】：生物工程学报. 2020年02期 北大核心
【文章页数】：16 页
【部分图文】：
艰难梭菌基因编辑技术的不同发展阶段[10-11,16,19,23-30]
2002年，Purdy等发现了CD630内源质粒pCD6，该质粒大小为6 829 bp,GC含量为24.5%，包含5个开放阅读框(Open reading frame,orf):orfA、orfB、orfC、orfD和orfE(图2)[23,33]。orfA大小为3 994 bp，编码复制蛋白，其下游有一段重复序列，可驱动质粒在CD630中复制。orfB编码未知功能肽段且不是复制必需的。orfC和ofrD也位于复制区域，但是功能未知。orfE编码长度为187个氨基酸的蛋白质，与胞壁酰五肽羧肽酶有相似性，推测参与细胞壁的生物合成。Purdy等使用pCD6复制子(orfA)构建了pMTL9301质粒，该质粒在艰难梭菌中的转化效率较高(5.7×10–5转化子/质粒供体)。连续传代实验表明，p MTL9301在艰难梭菌中可以稳定复制。在无抗生素的培养基中连续32次传代后，仅有8%的克隆丢失质粒。相比之下，pMTL9401(pB102复制子)在同样的培养条件下，有96%的菌体丢失了质粒[23]。因此pCD6复制子被用于构建大肠杆菌-艰难梭菌穿梭质粒[34]。该质粒可在大肠杆菌(CA434)协助质粒(Helper plasmid)的帮助下，通过结合转移的方式进入艰难梭菌中，并可在其中稳定复制[23]。1.3 突破限制性内切酶屏障，建立外源质粒转化方法
2007年，梭菌基因编辑的先驱Minton研究组，Heap等将来源于乳酸球菌ltrB基因的Ll.ltrB二型内含子与穿梭质粒融合，开发了首个能够在梭菌中通用的基因失活工具——ClosTron，该系统借助二型内含子可重编码的“归巢(Retrohoming)”效应[44-45]，成功地在艰难梭菌、丙酮丁醇梭菌和生孢梭菌C.sporogenes等菌株中实现了靶向基因失活(图4)[12,24-27]。该研究组在接下来的工作中进一步改进了ClosTron系统，如在ClosTron质粒上加入了转座激活筛选基因(Retrotranspositionactivated marker,RAM)，从而提高了突变株的筛选效率[46]；建立了免费的引物设计网站http://clostron.com，提高打靶效率；在质粒载体构建过程中加入蓝白斑筛选标记，从而提高载体构建和筛选的效率[25]。ClosTron技术可在10–14 d内快速获得靶基因失活突变株，因此极大地提高了梭菌属细菌突变株构建效率。该技术目前仍是艰难梭菌突变株构建的主要工具，并被深度开发为艰难梭菌必需基因检测手段[47]。2010年Minton研究组发表了使用ClosTron技术对艰难梭菌毒素基因的研究结果，他们发现Toxin A和Toxin B都具有细胞毒性，并都能够单独在仓鼠模型中诱导肠道疾病的发生[15]。
本文编号：2936832
【文章来源】：生物工程学报. 2020年02期 北大核心
【文章页数】：16 页
【部分图文】：
艰难梭菌基因编辑技术的不同发展阶段[10-11,16,19,23-30]
2002年，Purdy等发现了CD630内源质粒pCD6，该质粒大小为6 829 bp,GC含量为24.5%，包含5个开放阅读框(Open reading frame,orf):orfA、orfB、orfC、orfD和orfE(图2)[23,33]。orfA大小为3 994 bp，编码复制蛋白，其下游有一段重复序列，可驱动质粒在CD630中复制。orfB编码未知功能肽段且不是复制必需的。orfC和ofrD也位于复制区域，但是功能未知。orfE编码长度为187个氨基酸的蛋白质，与胞壁酰五肽羧肽酶有相似性，推测参与细胞壁的生物合成。Purdy等使用pCD6复制子(orfA)构建了pMTL9301质粒，该质粒在艰难梭菌中的转化效率较高(5.7×10–5转化子/质粒供体)。连续传代实验表明，p MTL9301在艰难梭菌中可以稳定复制。在无抗生素的培养基中连续32次传代后，仅有8%的克隆丢失质粒。相比之下，pMTL9401(pB102复制子)在同样的培养条件下，有96%的菌体丢失了质粒[23]。因此pCD6复制子被用于构建大肠杆菌-艰难梭菌穿梭质粒[34]。该质粒可在大肠杆菌(CA434)协助质粒(Helper plasmid)的帮助下，通过结合转移的方式进入艰难梭菌中，并可在其中稳定复制[23]。1.3 突破限制性内切酶屏障，建立外源质粒转化方法
2007年，梭菌基因编辑的先驱Minton研究组，Heap等将来源于乳酸球菌ltrB基因的Ll.ltrB二型内含子与穿梭质粒融合，开发了首个能够在梭菌中通用的基因失活工具——ClosTron，该系统借助二型内含子可重编码的“归巢(Retrohoming)”效应[44-45]，成功地在艰难梭菌、丙酮丁醇梭菌和生孢梭菌C.sporogenes等菌株中实现了靶向基因失活(图4)[12,24-27]。该研究组在接下来的工作中进一步改进了ClosTron系统，如在ClosTron质粒上加入了转座激活筛选基因(Retrotranspositionactivated marker,RAM)，从而提高了突变株的筛选效率[46]；建立了免费的引物设计网站http://clostron.com，提高打靶效率；在质粒载体构建过程中加入蓝白斑筛选标记，从而提高载体构建和筛选的效率[25]。ClosTron技术可在10–14 d内快速获得靶基因失活突变株，因此极大地提高了梭菌属细菌突变株构建效率。该技术目前仍是艰难梭菌突变株构建的主要工具，并被深度开发为艰难梭菌必需基因检测手段[47]。2010年Minton研究组发表了使用ClosTron技术对艰难梭菌毒素基因的研究结果，他们发现Toxin A和Toxin B都具有细胞毒性，并都能够单独在仓鼠模型中诱导肠道疾病的发生[15]。
本文编号：2936832
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