O-GlcNAc糖基化调节PKA的活性：影响学习记忆的新机制

发布时间：2017-04-09 15:04

  本文关键词：O-GlcNAc糖基化调节PKA的活性：影响学习记忆的新机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的蛋白激酶A(PKA)是一种受环腺苷酸(cAMP)激活的激酶,参与细胞内的糖、蛋白质及脂质代谢。早期研究表明,PKA能够通过cAMP反应元件结合蛋白(CREB)参与学习和记忆的过程。PKA全酶由一个调节亚基(R)二聚体和每个调节亚基结合的一个催化亚基(C)组成。PKA调节亚基在与2分子cAMP结合后发生构象改变,导致催化亚基的释放和激活。此外,也有研究表明PKA可不依赖cAMP活化。O-GlcNAc糖基化是一种蛋白的翻译后修饰,这一反应过程由O连接N-乙酰转移酶(OGT)和β-N-乙酰氨基酶(OGA)所调控。本文旨在研究PKA是否受到O-GlcNAc糖基化的调控,从而探讨AD患者大脑中葡萄糖摄入障碍通过下调PKA的O-GlcNAc糖基化引起学习记忆功能障碍的分子机制。方法1.在HEK-293FT细胞中过表达OGT增加细胞O-GlcNAc糖基化水平,通过免疫沉淀的方法检测PKA是否受到O-GlcNAc糖基化的修饰。2.在HepG2细胞中过表达OGT或OGA或shOGT以改变O-GlcNAc糖基化水平,然后用Western blots检测O-GlcNAc糖基化和PKA底物——CREB的磷酸化。3.在HEK-293FT细胞中分别过表达PKA催化亚基α或β,同时过表达OGT,经过免疫纯化PKA催化亚基,对人源重组tau蛋白体外磷酸化,通过点印迹检测tau的磷酸化水平。4.在大鼠代谢脑片中加入OGA抑制剂PUGNAc以提高O-GlcNAc糖基化水平,通过Western blot分析PKA下游底物tau在Ser214的磷酸化水平。5.饥饿小鼠使得大脑神经元葡萄糖的摄入降低以下调o-glcnac糖基化,通过westernblot分析o-glcnac糖基化和pka下游底物磷酸化的变化。6.条件性敲除小鼠前脑神经元ogt基因,通过westernblot分析o-glcnac糖基化、pka下游底物磷酸化、tau磷酸化、神经元和突触标记物的变化。7.小鼠侧脑室注射don抑制o-glcnac糖基化,检测下调o-glcnac糖基化对小鼠条件性恐惧相关记忆的影响,并通过westernblot分析海马o-glcnac糖基化、pka下游底物磷酸化的变化。8.通过慢性缺血模型,在ad模型/野生型小鼠中观察神经元长期葡萄糖摄入降低对o-glcnac糖基化、pka底物磷酸化和短期记忆、场景记忆的影响。结果1.免疫沉淀实验提示pka催化亚基α和β受到o-glcnac糖基化的修饰,过表达ogt使得pkac的糖基化水平增加。2.过表达ogt上调o-glcnac糖基化水平,使得creb磷酸化水平增加、过表达oga或shogt下调o-glcnac糖基化,使得creb的磷酸化水平下降。3.过表达ogt上调o-glcnac糖基化修饰,使得pkac催化tau磷酸化的激酶活性增加。4.在大鼠代谢脑片培养中,上调o-glcnac水平,tau蛋白在pka磷酸化位点ser214的磷酸化增加,而非pka位点thr205的磷酸化水平没有明显改变。5.饥饿使得小鼠大脑中o-glcnac糖基化水平下降,伴随着tau在ser214和creb在ser133的磷酸化水平降低、tau在thr205的磷酸化水平增加。6.特异性敲除小鼠神经元ogt基因后,小鼠前脑o-glcnac糖基化水平下降,伴随着tau在ser214、creb在ser133磷酸化水平下降和tau在thr205磷酸化水平的增加,以及神经元和突触标记物表达下降。7.侧脑室注射don使得小鼠脑中o-glcnac糖基化水平降低、tau在ser214、creb在ser133的磷酸化水平降低,小鼠在条件性恐惧实验中对环境和声音刺激的记忆力下降。8.慢性缺血使得野生型小鼠及3×Tg-AD模型小鼠探索能力上升,短期记忆和场景记忆力削弱。结论1.PKA催化亚基α和β受O-GlcNAc糖基化修饰。2.O-GlcNAc糖基化修饰影响PKA的活性。上调O-GlcNAc糖基化水平,使得PKA的活性增加,PKA催化的下游底物磷酸化水平增加;下调O-GlcNAc水平,使得PKA催化的下游底物的磷酸化水平降低。3.下调O-GlcNAc糖基化使得小鼠的认知功能和记忆力水平下降。
【关键词】：蛋白激酶A O-GlcNAc糖基化 CREB tau 慢性缺血
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 第一章 绪论12-15
• 第二章 材料与方法15-26
• 2.1 材料15-20
• 2.1.1 质粒15
• 2.1.2 细胞15
• 2.1.3 动物15-16
• 2.1.4 试剂16-18
• 2.1.5 抗体18-19
• 2.1.6 仪器19-20
• 2.2 方法20-25
• 2.2.1 细胞培养20
• 2.2.2 真核细胞转染20-21
• 2.2.3 蛋白质免疫印迹21
• 2.2.4 免疫沉淀和免疫共沉淀21-22
• 2.2.5 点印记22-23
• 2.2.6 大脑切片培养23
• 2.2.7 侧脑室注射（ICV）23-24
• 2.2.8 条件性恐惧24
• 2.2.9 小鼠单侧颈总动脉结扎慢性脑缺血模型24
• 2.2.10 高架十字迷宫24-25
• 2.2.11 矿场实验25
• 2.2.12 Morris水迷宫25
• 2.2.13 新物体识别25
• 2.3 数据统计25-26
• 第三章 结果26-45
• 3.1 PKA催化亚基受到O-GlcNAc糖基化的修饰26-27
• 3.2 改变O-GlcNAc糖基化水平影响CREB磷酸化水平27-28
• 3.3 O-GlcNAc糖基化使得PKA-C激酶活性增加28-31
• 3.4 药物处理提高糖基化水平对PKA催化亚基活性的影响31-32
• 3.5 饥饿导致的O-GlcNAc糖基化水平降低下调PKA催化活性32-33
• 3.6 敲除小鼠前脑神经元OGT对PKA催化底物磷酸化的影响33-37
• 3.6.1 前脑神经元OGT敲除小鼠，O-GlcNAc糖基化水平下降，，PKA底物磷酸化下降33-35
• 3.6.2 前脑神经元OGT敲除小鼠大脑内，tau磷酸化水平变化35
• 3.6.3 前脑神经元OGT敲除小鼠大脑内，神经元和突触标记物下降35-37
• 3.7 DON下调小鼠大脑糖基化水平对其学习记忆行为的影响37-40
• 3.7.1 药物抑制小鼠大脑糖基化水平，削弱了恐惧相关记忆37-38
• 3.7.2 DON抑制小鼠大脑糖基化水平、降低PKA催化活性38-40
• 3.8 小鼠慢性大脑缺血的行为学研究40-45
• 3.8.1 慢性缺血对小鼠探索性行为的影响40-42
• 3.8.2 慢性缺血对小鼠短期记忆影响42-43
• 3.8.3 慢性缺血对小鼠场景记忆影响43-44
• 3.8.4 慢性缺血对小鼠蛋白O-GlcNAc糖基化和磷酸化水平的影响44-45
• 第四章 讨论45-49
• 第五章 结论49-50
• 参考文献50-54
• 综述54-72
• 综述参考文献63-72
• 英文缩写词表72-73
• 在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目73-74
• 致谢74

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本文编号：295499