基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及鼠细胞模型探索
发布时间：2021-01-24 13:12
背景:人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）,经感染人体后可导致获得性缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）。联合抗逆转录病毒治疗（Combination Antiretroviral Therapy,cART）的运用,可以使 HIV-1 感染者体内的病毒复制数低于常规检测水平线以下,但不能使其完全清除。治疗HIV-1感染的主要困难就是清除这群潜伏的整合且具有复制能力的病毒储存库（viral reservoir）。目前对于检测病毒储存库方法很多,但是各有不足,如何能更精确快速找到病毒储存库,本研究论文提出问题,并且在目前被视为检测病毒储存库金标准的方法—体外扩增检测（viraloutgrowthassay,VOA）的基础上进行改进。由于HTV-1的生物学特性的复杂,目前尚无有效疫苗。对于HIV的研究,特别是HIV-1抗逆转录病毒治疗后,HIV-1感染变成慢性病,各种并发症的研究,需要动物模型。本文基于dCas9基因激活系统改进HIV-1体外扩增检测及利用dCas9基因激活系统与EcoHI...
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?Ａ?ｄＣａｓ９基因激活系统
ＨＳＦ１反式激活结构域融合共同形成了与ｄＣａｓ９协同作用并招募疱疹病毒转录激活??结构域的一个激活系统，即ｄＣａｓ９－ＳＡＭ基因激活，从而促进ｄＣａｓ９介导的基因激??活（图１Ａ），效力高达３０００倍。此激活系统的关键是需要在激活基因的启动子区??域寻找合适的ｇＲＮＡ，通过Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ和同ｇＲＮＡ识别序列互补的ＤＮＡ序列相??互作用，把转录起始因子带到相应基因启动子区域，启动该基因转录。ＨＩＶ的启??动子是位于病毒基因组５’端和３＇端ＬＴＲ区域（图１Ｂ）。为了更好的筛选出最合适??的ｇＲＮＡ，根据生物信息学分析，在ＬＴＲ的正反ＤＮＡ链上一共设计了可能的２０??条ｇＲＮＡ?（图１?Ｃ）进行下一步的筛选。??Ａ?ＭＳ２?＾ＨＳＰ１?Ｂ?ＨｉＮＭ?病毒獅??－４５４?－１０５?－７８?＋１?＋９８?＋１８２??图１?Ａ?ｄＣａｓ９基因激活系统?图１?Ｂ基于ｄＣａｓ９基因激活系统??构成示意图?能激活潜伏的ＨＩＶ示意图??ＨＩＶ－ｓｇＲＮＡ靶位点??正义链：Ｅ?ＡＪ?Ｔ?Ｋ?Ｌ?Ｎ?０?Ｐ?Ｄ?Ｒ?Ｒａ?Ｕ５ａ??反义链：?ＨＣＧ?Ｓ?Ｊ?Ｂ，Ｍ?Ｑ?Ｆ??ＮＦｋＢ?ＴＡＴＡ??■■?ＳＰ?■??－５００?－４００?－３００?－２００?－１００?■■■?＋１?＋１００?＋２００??Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒ?Ｅｎｈａｎｃｅｒ?Ｃｏｒｅ??图１?Ｃ根据ＨＩＶ?ＬＴＲ序列的正链和负链的ＤＮＡ序列设计的２０个靶位点示意图??２４??
３．２高效激活ＨＩＶ的ｇＲＮＡ的筛选与验证??首先根据设计的２０个靶位点，合成了?２０条ｇＲＮＡ，分别克隆入ｌｅｎｆｇＲＮＡ??（ＭＳ２）载体中，如图２?Ａ所示。??图２?Ａ上ＰＣＲ鉴定２０条ｇＲＮＡ克隆入ｌｅｎｔｉ－ｇＲＮＡ?（ＭＳ２）载体电泳图??Ｕ?＇?６?＇?＂?３?Ｔ?Ｇ?Ｇ?＇?＊?〇?Ｕ?＇?＇?．０?Ｏ?ＱＵＯ＇ＯＵＯＯＯ－＇Ｏ?０?＂?０?＇?ａ??通过设计ＰＣＲ引物，其产物为５０５ｂｐ为连接入载体的成功克隆；利用Ｕ６?ｐｒｏｍｏｔｅｒ通用引物测序结果??图２?Ａ下ｇＲＮＡ－Ｌ克隆入ｌｅｎｔｉ－ｇＲＮＡ?（ＭＳ２）载体的测序正确图??并用测试成功的载体分别小量包装成慢病毒。为减少ｇＲＮＡ对ＨＩＶ的激活可??能对于每一株细胞造成的差别，直接将要用于ＶＯＡ的扩增细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞系进??行筛选。通过慢病毒载体构建过表达ｄＣａｓ９－ｖｐ６４和ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦｌ细胞系，并用??潮霉素和嘌呤霉素筛选成ｊｕｒｋａｔ６４６５细胞系，然后用含有ＨＩＶ－Ｌｕｃ的假病毒颗粒??进一步感染Ｊｕｒｋａｔ６４６５细胞系，建立含有荧光素酶报告基因的Ｊｕｒｋａｔ６４６５－ＨＩＶ－Ｌｕｃ??细胞系。分别用包装好的２０种ｇＲＮＡ的不同的慢病毒感染Ｊｕｒｋａｔ６４６５－ＨＩＶ－Ｌｕｃ细??胞后，４８小时进行裂解细胞进行荧光素酶活性鉴定，结果如图２?Ｂ，选取了与对??照相比（Ｚｅｒｏ，为不含ｇＲＮＡ的慢病毒感染细胞）荧光素酶活性最高的ｇＲＮＡ编??号为Ｌ和Ｏ的ｇＲＮＡ进行验证。??为了验证筛选出的编号为Ｌ和０的ｇＲＮＡ对ＨＩＶ的激活和扩增效率
本文编号：2997307
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?Ａ?ｄＣａｓ９基因激活系统
ＨＳＦ１反式激活结构域融合共同形成了与ｄＣａｓ９协同作用并招募疱疹病毒转录激活??结构域的一个激活系统，即ｄＣａｓ９－ＳＡＭ基因激活，从而促进ｄＣａｓ９介导的基因激??活（图１Ａ），效力高达３０００倍。此激活系统的关键是需要在激活基因的启动子区??域寻找合适的ｇＲＮＡ，通过Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ和同ｇＲＮＡ识别序列互补的ＤＮＡ序列相??互作用，把转录起始因子带到相应基因启动子区域，启动该基因转录。ＨＩＶ的启??动子是位于病毒基因组５’端和３＇端ＬＴＲ区域（图１Ｂ）。为了更好的筛选出最合适??的ｇＲＮＡ，根据生物信息学分析，在ＬＴＲ的正反ＤＮＡ链上一共设计了可能的２０??条ｇＲＮＡ?（图１?Ｃ）进行下一步的筛选。??Ａ?ＭＳ２?＾ＨＳＰ１?Ｂ?ＨｉＮＭ?病毒獅??－４５４?－１０５?－７８?＋１?＋９８?＋１８２??图１?Ａ?ｄＣａｓ９基因激活系统?图１?Ｂ基于ｄＣａｓ９基因激活系统??构成示意图?能激活潜伏的ＨＩＶ示意图??ＨＩＶ－ｓｇＲＮＡ靶位点??正义链：Ｅ?ＡＪ?Ｔ?Ｋ?Ｌ?Ｎ?０?Ｐ?Ｄ?Ｒ?Ｒａ?Ｕ５ａ??反义链：?ＨＣＧ?Ｓ?Ｊ?Ｂ，Ｍ?Ｑ?Ｆ??ＮＦｋＢ?ＴＡＴＡ??■■?ＳＰ?■??－５００?－４００?－３００?－２００?－１００?■■■?＋１?＋１００?＋２００??Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒ?Ｅｎｈａｎｃｅｒ?Ｃｏｒｅ??图１?Ｃ根据ＨＩＶ?ＬＴＲ序列的正链和负链的ＤＮＡ序列设计的２０个靶位点示意图??２４??
３．２高效激活ＨＩＶ的ｇＲＮＡ的筛选与验证??首先根据设计的２０个靶位点，合成了?２０条ｇＲＮＡ，分别克隆入ｌｅｎｆｇＲＮＡ??（ＭＳ２）载体中，如图２?Ａ所示。??图２?Ａ上ＰＣＲ鉴定２０条ｇＲＮＡ克隆入ｌｅｎｔｉ－ｇＲＮＡ?（ＭＳ２）载体电泳图??Ｕ?＇?６?＇?＂?３?Ｔ?Ｇ?Ｇ?＇?＊?〇?Ｕ?＇?＇?．０?Ｏ?ＱＵＯ＇ＯＵＯＯＯ－＇Ｏ?０?＂?０?＇?ａ??通过设计ＰＣＲ引物，其产物为５０５ｂｐ为连接入载体的成功克隆；利用Ｕ６?ｐｒｏｍｏｔｅｒ通用引物测序结果??图２?Ａ下ｇＲＮＡ－Ｌ克隆入ｌｅｎｔｉ－ｇＲＮＡ?（ＭＳ２）载体的测序正确图??并用测试成功的载体分别小量包装成慢病毒。为减少ｇＲＮＡ对ＨＩＶ的激活可??能对于每一株细胞造成的差别，直接将要用于ＶＯＡ的扩增细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞系进??行筛选。通过慢病毒载体构建过表达ｄＣａｓ９－ｖｐ６４和ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦｌ细胞系，并用??潮霉素和嘌呤霉素筛选成ｊｕｒｋａｔ６４６５细胞系，然后用含有ＨＩＶ－Ｌｕｃ的假病毒颗粒??进一步感染Ｊｕｒｋａｔ６４６５细胞系，建立含有荧光素酶报告基因的Ｊｕｒｋａｔ６４６５－ＨＩＶ－Ｌｕｃ??细胞系。分别用包装好的２０种ｇＲＮＡ的不同的慢病毒感染Ｊｕｒｋａｔ６４６５－ＨＩＶ－Ｌｕｃ细??胞后，４８小时进行裂解细胞进行荧光素酶活性鉴定，结果如图２?Ｂ，选取了与对??照相比（Ｚｅｒｏ，为不含ｇＲＮＡ的慢病毒感染细胞）荧光素酶活性最高的ｇＲＮＡ编??号为Ｌ和Ｏ的ｇＲＮＡ进行验证。??为了验证筛选出的编号为Ｌ和０的ｇＲＮＡ对ＨＩＶ的激活和扩增效率
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