大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定
发布时间：2021-01-27 12:25
目的 :构建大鼠IL-6基因启动子（全长和截短）荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞（HEK293）中过表达CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ）对该质粒基因启动子活性的影响。同时,筛选C/EBPβ与IL-6基因启动子区的结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列（-1 791～+30 nt）,将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒（pGL3-IL-6-1）和大鼠野生型C/EBPβ表达质粒（pIRES2-EGFP-C/EBPβ）共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBPβ对IL-6基因的启动作用。另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBPβ潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒（即pGL3-IL-6-2～5）。将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBPβ过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBPβ的结合位点。结果:菌...
【文章来源】：南京医科大学学报(自然科学版). 2013,33(06)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
／EBPβ过表达对大鼠IL-6蛋白表达的影响
rluciferaseactivity（fold）86420*1：pGL3-IL-6-1＋pIRES2；2：pGL3-IL-6-1＋pIRES2-EGFP-C／EBPβ；3：pIRES2；4：pGL3-basic。与1、3、4组比较，*P＜0．001（n＝3）图3C／EBPβ对于大鼠IL-6基因启动子全长活性的影响Figure3TheeffectofC／EBPβontheluciferaseactivityofratIL-6genepromoter（full-length）A：PCR扩增结果，M：DNAMarker；1～3：3个克隆的pGL3-IL-6-1质粒菌液PCR扩增产物；B：重组IL-6启动子荧光素酶报告质粒的测序图谱（部分）。图1重组IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的鉴定Figure1IdentificationofluciferasereporterplasmidforIL-6genepromoter200010007502501005001821bpbpM123ApGL3-basic／IL-6-1B1234庞蓉蓉等：大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C／EBPβ结合位点的鉴定第33卷第6期2013年6月·725·
-6-1质粒共转染HEK293细胞，检测各组细胞的荧光素酶活性，结果发现，将pGL3-IL-6-1与pIRES2-EGFP-C／EBPβ共转染后，其荧光素酶活性明显强于pGL-3-basic对照组。提示C／EBPβ作为转录因子能够启动IL-6基因的转录。已有研究发现，C／EBPβ可以促进人IL-6基因的表达［11］。另有实验证实，C／EBPβ作为一种转录因子能与小鼠IL-6基因启动子上的效应元件相结合，启动IL-6的基因转录，实现对IL-6的调控［12－13］。为了确定大鼠C／EBPβ与IL-6基因启动子的结合区域，先通过TFSearch软件预测出IL-6基因启动子上含图4各截短荧光素酶报告质粒菌液PCR鉴定Figure4PCRindentificationofdifferenttruncatedluciferasereporterplasmids20001000750500250100bpMarkerpGL3-IL-6-21422bp920bpMarkerMarker648bpMarker456bppGL3-IL-6-3pGL3-IL-6-4pGL3-IL-6-5*IL-6promoterluciferaseactivity（fold）150100500＃1～5：分别为pGL3-IL-6-1、pGL3-IL-6-2、pGL3-IL-6-3、pGL3-IL-6-4、pGL3-IL-6-5与pIRES2-EGFP-C／EBPβ共转染组；6：pGL3-Basic组。与6组比较，＃P＜0．001；与1～4组比较，*P＜0．001（n＝3）。图5C／EBPβ过表达对于大鼠IL-6基因启动子（各截短）活性的影响Figure5TheeffectsofC／EBPβoverexpressionontheactivityofdifferenttruncatedratIL-6genepromoter123456·726·
【参考文献】：
期刊论文
[1]大鼠Caspase8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定[J]. 单锴,邱文,李妍,周建博,刘丽莎,赵聃,王迎伟. 南京医科大学学报(自然科学版). 2013(03)
本文编号：3003042
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【部分图文】：
／EBPβ过表达对大鼠IL-6蛋白表达的影响
rluciferaseactivity（fold）86420*1：pGL3-IL-6-1＋pIRES2；2：pGL3-IL-6-1＋pIRES2-EGFP-C／EBPβ；3：pIRES2；4：pGL3-basic。与1、3、4组比较，*P＜0．001（n＝3）图3C／EBPβ对于大鼠IL-6基因启动子全长活性的影响Figure3TheeffectofC／EBPβontheluciferaseactivityofratIL-6genepromoter（full-length）A：PCR扩增结果，M：DNAMarker；1～3：3个克隆的pGL3-IL-6-1质粒菌液PCR扩增产物；B：重组IL-6启动子荧光素酶报告质粒的测序图谱（部分）。图1重组IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的鉴定Figure1IdentificationofluciferasereporterplasmidforIL-6genepromoter200010007502501005001821bpbpM123ApGL3-basic／IL-6-1B1234庞蓉蓉等：大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C／EBPβ结合位点的鉴定第33卷第6期2013年6月·725·
-6-1质粒共转染HEK293细胞，检测各组细胞的荧光素酶活性，结果发现，将pGL3-IL-6-1与pIRES2-EGFP-C／EBPβ共转染后，其荧光素酶活性明显强于pGL-3-basic对照组。提示C／EBPβ作为转录因子能够启动IL-6基因的转录。已有研究发现，C／EBPβ可以促进人IL-6基因的表达［11］。另有实验证实，C／EBPβ作为一种转录因子能与小鼠IL-6基因启动子上的效应元件相结合，启动IL-6的基因转录，实现对IL-6的调控［12－13］。为了确定大鼠C／EBPβ与IL-6基因启动子的结合区域，先通过TFSearch软件预测出IL-6基因启动子上含图4各截短荧光素酶报告质粒菌液PCR鉴定Figure4PCRindentificationofdifferenttruncatedluciferasereporterplasmids20001000750500250100bpMarkerpGL3-IL-6-21422bp920bpMarkerMarker648bpMarker456bppGL3-IL-6-3pGL3-IL-6-4pGL3-IL-6-5*IL-6promoterluciferaseactivity（fold）150100500＃1～5：分别为pGL3-IL-6-1、pGL3-IL-6-2、pGL3-IL-6-3、pGL3-IL-6-4、pGL3-IL-6-5与pIRES2-EGFP-C／EBPβ共转染组；6：pGL3-Basic组。与6组比较，＃P＜0．001；与1～4组比较，*P＜0．001（n＝3）。图5C／EBPβ过表达对于大鼠IL-6基因启动子（各截短）活性的影响Figure5TheeffectsofC／EBPβoverexpressionontheactivityofdifferenttruncatedratIL-6genepromoter123456·726·
【参考文献】：
期刊论文
[1]大鼠Caspase8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定[J]. 单锴,邱文,李妍,周建博,刘丽莎,赵聃,王迎伟. 南京医科大学学报(自然科学版). 2013(03)
本文编号：3003042
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