朊蛋白对细胞生长及炎症反应的影响
发布时间：2021-01-30 10:14
朊蛋白（Prion protein,PrP）是位于细胞膜表面的糖蛋白,由PRNP基因所编码的253个氨基酸组成,在机体内多个组织和器官中广泛表达,其构象错构则会转变为具有传染性的朊病毒(PrPSC)。既往对朊病毒在传播途径和致病机理等方面已有了较深入的研究,但对朊蛋白的正常生理功能则所知甚少,而在神经系统以外的功能则更不明了。本研究通过利用CRISPR-Cas9和慢病毒载体的RNAi技术对不同细胞系（人结肠癌细胞系HT29以及人淋巴瘤细胞系U937）的PrP表达量进行敲除/敲低来探究PrP对于细胞的生长和炎症反应的影响,在分子水平上研究PrP的生理功能。本实验结果显示,通过CRISPR-Cas9和慢病毒载体的RNAi技术所构建的不同细胞系的PrP表达量在WB检测时均显著低于对照组,证明我们成功构建了PrP的敲低/敲除细胞系,包括HT29-PrP-/-系,HT29-siPrP系和U937-siPrP系。之后我们对三种细胞系进行了生长及炎症反应的研究。MTT结果显示PrP表达量的降低引起了三种细胞系生长增殖速度的变慢。考虑到U937作为淋巴瘤细胞...
【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Guide#1在PRNP基因中的位置
图 3.2pSpCas9(BB)-2A-Puro 质粒的关键信息。图中左侧第 个红框所标记的是 U6 启区域，在的 SgRNA 序列的整合区域之前，是测序的起始序列；第二个红框为 SgRNA 序列的整合域；紫色区域为 Cas9 蛋白的序列；第三个红框为药物筛选位点。Fig.3.2 The key site of pSpCas9(BB)-2A-Puro plasmid. The first red box on thof the figure marks the U6 promoter region, which is the starting sequence for sequencing beforeintegration region of our SgRNA sequence; the second red box is the integrated region of the SgRsequence; the purple region isThe sequence of the Cas9 protein; the third red box is our drug screening将最终抽提出来的质粒进行单酶切和双酶切验证后，对比其酶切后分子小与 DNAMarker 的位置，所出现的条带大小与报道的质粒的大小相符合，需进 步确定设计的 SgRNA 是否整合到质粒中，以确定其为我们所需要的其电泳结果如下图所示：
图 3.3 质粒酶切后的电泳结果。图中第 泳道为Marker，第二泳道为酶切对照组，第三泳道为 Apal 酶切组，第四泳道为 Xbal 酶切组，第五泳道为 Apal 和 Xbal 的双酶切组，第六泳道为质粒原溶液组。Fig.3.3 The result of plasmid Enzyme digestion. In the figure, the first lane is Marker,the second lane is the enzyme digestion control group, the third lane isApal digestion group, the fourth laneis Xbal digestion group, and the fifth lane isApal and Xbal ,the sixth lane is the plasmid stock group.为了进 步确定设计的 SgRNA 是否整合到质粒中，再将该质粒送往公司进行测序，检测所设计的 SgRNA 是否有效地整合到了该质粒之中。对公司所反馈的测序结果与我们所设计的 SgRNA 进行比对，其对比的测序结果如下图所示：
【参考文献】：
硕士论文
[1]朊蛋白在LPS诱导的结肠炎症中的作用研究[D]. 王庆文.华东师范大学 2018
[2]内源性朊蛋白在结肠炎相关性结肠癌中的作用的研究[D]. 巩昌国.华东师范大学 2016
本文编号：3008720
【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Guide#1在PRNP基因中的位置
图 3.2pSpCas9(BB)-2A-Puro 质粒的关键信息。图中左侧第 个红框所标记的是 U6 启区域，在的 SgRNA 序列的整合区域之前，是测序的起始序列；第二个红框为 SgRNA 序列的整合域；紫色区域为 Cas9 蛋白的序列；第三个红框为药物筛选位点。Fig.3.2 The key site of pSpCas9(BB)-2A-Puro plasmid. The first red box on thof the figure marks the U6 promoter region, which is the starting sequence for sequencing beforeintegration region of our SgRNA sequence; the second red box is the integrated region of the SgRsequence; the purple region isThe sequence of the Cas9 protein; the third red box is our drug screening将最终抽提出来的质粒进行单酶切和双酶切验证后，对比其酶切后分子小与 DNAMarker 的位置，所出现的条带大小与报道的质粒的大小相符合，需进 步确定设计的 SgRNA 是否整合到质粒中，以确定其为我们所需要的其电泳结果如下图所示：
图 3.3 质粒酶切后的电泳结果。图中第 泳道为Marker，第二泳道为酶切对照组，第三泳道为 Apal 酶切组，第四泳道为 Xbal 酶切组，第五泳道为 Apal 和 Xbal 的双酶切组，第六泳道为质粒原溶液组。Fig.3.3 The result of plasmid Enzyme digestion. In the figure, the first lane is Marker,the second lane is the enzyme digestion control group, the third lane isApal digestion group, the fourth laneis Xbal digestion group, and the fifth lane isApal and Xbal ,the sixth lane is the plasmid stock group.为了进 步确定设计的 SgRNA 是否整合到质粒中，再将该质粒送往公司进行测序，检测所设计的 SgRNA 是否有效地整合到了该质粒之中。对公司所反馈的测序结果与我们所设计的 SgRNA 进行比对，其对比的测序结果如下图所示：
【参考文献】：
硕士论文
[1]朊蛋白在LPS诱导的结肠炎症中的作用研究[D]. 王庆文.华东师范大学 2018
[2]内源性朊蛋白在结肠炎相关性结肠癌中的作用的研究[D]. 巩昌国.华东师范大学 2016
本文编号：3008720
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