ETEC K88细胞适配体的筛选和快速检测研究

发布时间：2017-04-13 19:20

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【摘要】：大肠杆菌(E.coli)引起的腹泻在世界范围内成为了一个主要的公共卫生问题。其中产肠毒素大肠杆菌K88(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC K88)是一种最常见的引起腹泻的致病菌。它易于通过食物摄取进入体内,极易使新生儿和断奶仔猪的胃肠道发生感染。因此,建立一种新的快速灵敏检测ETEC K88的方法是非常必要的。适配体(Aptamer)是ssDNA或者RNA,可以与靶标进行高亲和力和高特异性的结合。目前适配体常用的筛选手段为指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)。其靶标包括金属离子、有机小分子、药物、甚至单分子蛋白质和细胞。与传统的抗体相比,它具有廉价、易合成和可修饰的优点,被广泛的应用于分子检测、诊断治疗和生物标记物发现等领域。石墨烯具有独特的平面结构和优良的导电、导热性。氧化石墨烯(GO)是一种富氧基团(C/O≈2)的石墨烯,与石墨烯相比它极大的增强了亲和性及水溶性。同时,作为一种高效的荧光淬灭剂,它能够淬灭荧光体(上转换纳米材料、量子点及染料分子)的荧光,能稳定的吸附ss DNA。近年来,利用GO优良的特性,相继开发了各种纳米生物传感器。本论文以ETEC K88为目标细菌,通过SELEX方法筛选出细胞适配体,并测定适配体与靶标之间的亲和力和特异性;构建了以细胞适配体为特异性探针,以GO为荧光淬灭剂的纳米生物传感器用于ETEC K88的快速检测。具体实验结果如下:一、采用CELL-SELEX技术,通过11轮正筛选和4轮反筛选,获得了一组富集度高、特异性强的适配体序列。经纯化和克隆,得到37个阳性克隆子。测序后进行一级同源性比对和二级结构分析,可将它们分成三个家族。其中适配体A04的亲和力最高(Kd=28 nmol)。后续实验表明,ETEC K88与适配体A04的结合具有高特异性和灵敏性。二、利用GO纳米荧光淬灭剂的特性以及Klenow fragment(KF)-辅助靶标循环放大的功能,构建了一种新型的纳米传感器用于ETEC K88的快速检测。该传感器包括捕获探针和信号探针。靶标加入前两个探针形成了部分双链结构(PDSJ)并且吸附在石墨烯上,此时荧光淬灭。当加入靶标后,靶标与PDSJ形成了复合物,从而使PDSJ从GO上释放出来,荧光得以恢复。随后KF的加入引发了PDSJ的聚合反应,从而置换出靶标,置换出来的靶标能够与其它的PDSJ结合,进入下一轮循环。靶标的循环利用使更多的PDSJ得以释放,检测的荧光信号显著加强。实验结果表明,在菌体浓度102~108CFU·m L-1范围内,该传感器具有高特异性和灵敏性,线性关系良好,相关系数R2=0.9907。其检测下限达到了102 CFU·mL-1,比其他方法低10倍。
【关键词】：适配体筛选 ETEC K88检测 氧化石墨烯 Klenow fragment
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.21;S852.612
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第1章 绪论12-25
• 1.1 大肠杆菌的危害、致病机理及检测意义12-14
• 1.2 常见的大肠杆菌检测方法的研究现状及进展14-17
• 1.2.1 传统方法14-15
• 1.2.2 分子生物学方法15-16
• 1.2.3 免疫学方法16-17
• 1.2.4 以生物传感器为基础的方法17
• 1.3 核酸适配体17-22
• 1.3.1 适配体筛选原理及流程17-20
• 1.3.2 适配体与靶标分子的结合原理20
• 1.3.3 适配体的特点20-21
• 1.3.4 适配体的应用及进展21-22
• 1.4 纳米材料石墨烯22-23
• 1.4.1 石墨烯结构及性质22
• 1.4.2 石墨烯应用22-23
• 1.5 本论文的工作思路23-25
• 第2章 筛选ETEC K88细胞适配体25-39
• 2.1 引言25
• 2.2 实验仪器试剂与材料25-28
• 2.2.1 主要实验仪器25-26
• 2.2.2 菌株培养与预处理26
• 2.2.3 序列合成26-27
• 2.2.4 试剂和溶液27-28
• 2.3 实验方法28-31
• 2.3.1 Cell-SELEX过程28-30
• 2.3.2 次级文库结合率测定30
• 2.3.3 克隆和测序30
• 2.3.4 序列比对和分析30
• 2.3.5 适配体亲和力的测定30-31
• 2.3.6 灵敏性实验31
• 2.3.7 特异性实验31
• 2.4 实验结果与分析31-38
• 2.4.1 SELEX筛选条件的优化31-32
• 2.4.2 次级文库与ETEC K88结合率测定32-33
• 2.4.3 序列比对和分析33-35
• 2.4.4 亲和力分析35-37
• 2.4.5 灵敏性测定37
• 2.4.6 特异性分析37-38
• 2.5 小结与讨论38-39
• 第3章 基于氧化石墨烯纳米淬灭剂和Klenow fragment引发靶标循环放大的纳米生物传感器在ETEC K88检测中的应用39-53
• 3.1 引言39
• 3.2 纳米生物传感器的工作原理39-40
• 3.3 实验仪器及试剂40-42
• 3.3.1 实验仪器40-41
• 3.3.2 实验试剂41-42
• 3.4 实验方法42-44
• 3.4.1 氧化石墨烯的预处理42
• 3.4.2 体系可行性荧光分析42
• 3.4.3 体系可行性电泳分析42-43
• 3.4.4 体系工作条件优化43
• 3.4.5 体系灵敏性检测43
• 3.4.6 体系特异性检测43-44
• 3.4.7 体系用于粪便样本中ETEC K88检测44
• 3.5 实验结果与讨论44-51
• 3.5.1 体系机制荧光分析44-45
• 3.5.2 体系机制电泳分析45-46
• 3.5.3 体系工作条件优化结果与分析46-48
• 3.5.4 体系灵敏性检测结果48-49
• 3.5.5 体系特异性检测结果49-50
• 3.5.6 粪便样本中ETEC K88检测结果50-51
• 3.6 小结与讨论51-53
• 第4章 结论与展望53-55
• 4.1 结论53-54
• 4.2 展望54-55
• 参考文献55-63
• 攻读硕士学位期间撰写、发表的学术论文63-64
• 致谢64-66
• 附录66

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1 凌敏;ETEC K88细胞适配体的筛选和快速检测研究[D];湖南师范大学;2015年

  本文关键词：ETEC K88细胞适配体的筛选和快速检测研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304307