寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys激活炎症因子表达及诱导细胞凋亡和焦亡的研究
发布时间：2021-02-27 10:36
目的观察寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys后引起炎症因子的变化,以及诱导细胞死亡的方式。方法用寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys,在不同时间点收集细胞培养上清并提取细胞总RNA和细胞总蛋白。采用Luminex xMAP技术检测上清中GM-CSF、IL-6、IL-8、TNFα、CCL-2、MDC、CCL-5、INFα、MDC、IL-12p70细胞因子含量;采用荧光定量PCR检测目的基因在mRNA水平的相对表达量;采用Western blot检测目的基因在蛋白水平的相对表达量;采用CCK-8检测细胞活力;采用LDH释放试验检测细胞膜损伤程度;采用流式细胞术检测细胞Annexin V-FITC/PI双标染色细胞分群。结果寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys后引起GM-CSF、IL-6、IL-8、TNFα、CCL-2、CCL-5分泌增加,荧光定量PCR结果与Luminex xMAP检测结果一致;寨卡病毒感染HUVECs和SH-SY5Ys 72h后焦亡相关基因在mRNA水平表达增加,焦亡相关蛋白被激活,细胞活力下降50%,细胞膜完整性丧失,转染siRNA-NLRP3或加入N...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2020,15(07)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
寨卡病毒感染SH-SY5Ys引起的细胞焦亡
将HUVECs接种于96板中,用不同MOI的寨卡病毒感染细胞,分别在感染后12、24、48、72 h用CCK-8检测细胞活力,用LDH释放检测试剂盒检测各组LDH释放程度,评估细胞膜完整性。结果显示,在病毒感染72 h,MOI分别为1和10时细胞活力下降至56%、51%,差异有统计学意义(P<0.01)(图2A)。病毒感染48～72 h,MOI为1和10实验组的LDH释放量相对于对照组增加10%～13%,差异有统计学意义(P<0.01)(图2B),说明寨卡病毒感染HUVECs后细胞膜完整性丧失。因此将寨卡病毒感染后48 h和72 h作为凋亡和焦亡研究的时间点。将HUVECs接种于6孔板中,处理方法同前,用荧光定量PCR检测寨细胞内焦亡相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达情况。结果显示,寨卡病毒感染72 h后,当MOI分别是0.1、1、10时,NLRP3相对表达量依次为对照组的6.25、8.94、5.9倍,Caspase-1的相对表达量依次为对照组的2.08、2.36、2.35倍,IL-1β相对表达量依次为对照组的4.5、5.58、3.67倍,差异均有统计学意义(均P<0.05),寨卡病毒在HUVECs中可持续复制,随着时间的增加,MOI越大,病毒的相对表达量越高(图2C)。用Western blot检测焦亡相关基因在蛋白水平的表达情况,结果显示寨卡病毒感染72 h后,Caspase-1和IL-1β活性片段的条带明显加深(图2D),表明寨卡病毒感染HUVECs后Caspase-1和IL-1β被激活。初步说明寨卡病毒感染HUVECs后发生了焦亡。
将HUVECs接种于6孔板中,处理方法同前,用荧光定量PCR检测寨细胞内焦亡相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达情况。结果显示,寨卡病毒感染72 h后,当MOI分别是0.1、1、10时,NLRP3相对表达量依次为对照组的6.25、8.94、5.9倍,Caspase-1的相对表达量依次为对照组的2.08、2.36、2.35倍,IL-1β相对表达量依次为对照组的4.5、5.58、3.67倍,差异均有统计学意义(均P<0.05),寨卡病毒在HUVECs中可持续复制,随着时间的增加,MOI越大,病毒的相对表达量越高(图2C)。用Western blot检测焦亡相关基因在蛋白水平的表达情况,结果显示寨卡病毒感染72 h后,Caspase-1和IL-1β活性片段的条带明显加深(图2D),表明寨卡病毒感染HUVECs后Caspase-1和IL-1β被激活。初步说明寨卡病毒感染HUVECs后发生了焦亡。将HUVECs接种于6孔板中,处理方法同前,用凋亡检测试剂盒检测不同时间点、不同MOI凋亡细胞群的分布情况。结果显示,处于Q2即PI阴性而Annexin-V FITC阳性的早期凋亡细胞群和处于Q3即PI和Annexin-V FITC双阳性的晚期凋亡细胞群着时间的延长,MOI越大,这两部分细胞越多。感染72 h后,MOI为10的Q2+Q3细胞比例达18%,是对照组的4倍,初步判断寨卡病毒感染HUVECs后发生了凋亡(图2F)。同时,提取细胞内总蛋白,检测凋亡相关基因蛋白含量的变化,结果显示寨卡病毒感染72 h后,细胞内Caspase-3的活性片段和BAX的蛋白表达水平与对照组相比明显增加,说明寨卡病毒感染HUVECs后发生了依赖于Caspase-3激活的细胞凋亡,与流式结果相互印证(图2E)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification of various cell culture models for the study of Zika virus[J]. Kiyoshi Himmelsbach,Eberhard Hildt. World Journal of Virology. 2018(01)
本文编号：3054106
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2020,15(07)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
寨卡病毒感染SH-SY5Ys引起的细胞焦亡
将HUVECs接种于96板中,用不同MOI的寨卡病毒感染细胞,分别在感染后12、24、48、72 h用CCK-8检测细胞活力,用LDH释放检测试剂盒检测各组LDH释放程度,评估细胞膜完整性。结果显示,在病毒感染72 h,MOI分别为1和10时细胞活力下降至56%、51%,差异有统计学意义(P<0.01)(图2A)。病毒感染48～72 h,MOI为1和10实验组的LDH释放量相对于对照组增加10%～13%,差异有统计学意义(P<0.01)(图2B),说明寨卡病毒感染HUVECs后细胞膜完整性丧失。因此将寨卡病毒感染后48 h和72 h作为凋亡和焦亡研究的时间点。将HUVECs接种于6孔板中,处理方法同前,用荧光定量PCR检测寨细胞内焦亡相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达情况。结果显示,寨卡病毒感染72 h后,当MOI分别是0.1、1、10时,NLRP3相对表达量依次为对照组的6.25、8.94、5.9倍,Caspase-1的相对表达量依次为对照组的2.08、2.36、2.35倍,IL-1β相对表达量依次为对照组的4.5、5.58、3.67倍,差异均有统计学意义(均P<0.05),寨卡病毒在HUVECs中可持续复制,随着时间的增加,MOI越大,病毒的相对表达量越高(图2C)。用Western blot检测焦亡相关基因在蛋白水平的表达情况,结果显示寨卡病毒感染72 h后,Caspase-1和IL-1β活性片段的条带明显加深(图2D),表明寨卡病毒感染HUVECs后Caspase-1和IL-1β被激活。初步说明寨卡病毒感染HUVECs后发生了焦亡。
将HUVECs接种于6孔板中,处理方法同前,用荧光定量PCR检测寨细胞内焦亡相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达情况。结果显示,寨卡病毒感染72 h后,当MOI分别是0.1、1、10时,NLRP3相对表达量依次为对照组的6.25、8.94、5.9倍,Caspase-1的相对表达量依次为对照组的2.08、2.36、2.35倍,IL-1β相对表达量依次为对照组的4.5、5.58、3.67倍,差异均有统计学意义(均P<0.05),寨卡病毒在HUVECs中可持续复制,随着时间的增加,MOI越大,病毒的相对表达量越高(图2C)。用Western blot检测焦亡相关基因在蛋白水平的表达情况,结果显示寨卡病毒感染72 h后,Caspase-1和IL-1β活性片段的条带明显加深(图2D),表明寨卡病毒感染HUVECs后Caspase-1和IL-1β被激活。初步说明寨卡病毒感染HUVECs后发生了焦亡。将HUVECs接种于6孔板中,处理方法同前,用凋亡检测试剂盒检测不同时间点、不同MOI凋亡细胞群的分布情况。结果显示,处于Q2即PI阴性而Annexin-V FITC阳性的早期凋亡细胞群和处于Q3即PI和Annexin-V FITC双阳性的晚期凋亡细胞群着时间的延长,MOI越大,这两部分细胞越多。感染72 h后,MOI为10的Q2+Q3细胞比例达18%,是对照组的4倍,初步判断寨卡病毒感染HUVECs后发生了凋亡(图2F)。同时,提取细胞内总蛋白,检测凋亡相关基因蛋白含量的变化,结果显示寨卡病毒感染72 h后,细胞内Caspase-3的活性片段和BAX的蛋白表达水平与对照组相比明显增加,说明寨卡病毒感染HUVECs后发生了依赖于Caspase-3激活的细胞凋亡,与流式结果相互印证(图2E)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification of various cell culture models for the study of Zika virus[J]. Kiyoshi Himmelsbach,Eberhard Hildt. World Journal of Virology. 2018(01)
本文编号：3054106
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/3054106.html
