铁代谢基因HFE对H7N9亚型流感病毒感染影响的研究
发布时间：2021-02-28 10:28
H7N9流感病毒是2013年新出现在人群中的禽流感病毒,其也是继1997年人感染H5N1禽流感病毒后又一个先在人群中鉴定发现的禽流感病毒。这种新出现的病毒由野鸟的H7亚型和N9亚型流感病毒表面基因以及家禽的H9N2流感病毒内部基因重组而来。H7N9流感病毒已经存在于中国家禽群体中,而且表现出向人或其他哺乳动物模型传播的能力比H5Nx病毒更强。研究表明,在细菌及其他病毒感染过程中营养元素铁发挥了一定作用,而在H7N9流感病毒感染过程中铁是否发挥作用以及铁代谢基因HFE作为类MHC I分子的免疫功能尚未见报道,因此本研究对营养元素铁及其代谢基因hfe对H7N9流感病毒感染的影响及其机理进行了探讨。对H7N9流感病毒感染患者和H7N9流感病毒流行期间无症状人群血清检测发现,H7血凝抗体阳性者均表现血清ferritin含量升高,血清铁含量降低,表明铁在H7N9流感病毒感染过程中的重要性。H7N9流感病毒感染小鼠富铁、缺铁模型试验结果显示,富铁组体重与正常铁组体重相比偏低,且下降迅速回升缓慢;而缺铁组与正常组相比同期体重较高;感染后富铁组小鼠死亡出现最早（第4天）,14天内死亡率达到41.1%,...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：156 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
研究意义
技术路线
第一部分 文献综述
第一章 我国H7N9流感病毒的概况
1.1 人感染H7N9流感病毒的出现和流行
1.2 H7N9流感病毒的溯源
1.3 H7N9流感病毒的进化、传播和发展
第二章 流感病毒感染的先天免疫应答
2.1 先天免疫对流感病毒感染的识别
2.1.1 TLR介导的流感病毒感染的识别
2.1.2 RIG-I监视感染细胞内复制中的病毒RNA
2.1.3 NLRP3炎性体感知细胞的损伤
2.2 抗流感病毒的ISGs
2.3 疾病耐受性抗感染的机理
2.4 诱导适应性免疫的先天信号途径
第三章 铁代谢及其对病原感染时先天免疫应答的影响
3.1 全身铁代谢
3.2 铁蛋白对疾病的影响
3.2.1 铁调素
3.2.2 乳铁蛋白
3.2.3 噬铁蛋白
3.2.4 亚铁血红素铁因子
3.2.5 非亚铁血红素铁因子
3.3 铁代谢对病毒感染的影响
3.3.1 病毒靶定铁代谢中的蛋白
3.3.2 铁螯合剂的抗病毒作用
第四章 血色沉着病相关基因HFE的研究进展
4.1 Hfe基因的定位与克隆
4.2 Hfe基因结构
4.3 HFE蛋白结构,细胞和组织分布
4.3.1 HFE蛋白结构
4.3.2 HFE在细胞和组织中的分布
4.4 HFE功能
4.4.1 Hfe敲除
4.4.2 Hfe敲入
4.4.3 铁吸收
第二部分 研究内容
第一章 H7N9流感病毒感染与体内铁水平的关系
1.1 实验材料与设备
1.1.1 实验材料
1.1.2 实验仪器
1.2 试验方法
1.2.1 血清铁和血清Ferritin检测
1.2.1.1 血清的获取
1.2.1.2 鸡胚扩繁A型流感病毒PR8、H7N9毒株
1.2.1.3 血凝实验
1.2.1.4 血凝抑制（HI）实验
1.2.1.5 血清铁、ferritin检测
1.2.2 不同铁水平小鼠的H7N9流感病毒感染
1.2.2.1 Bal B/C小鼠预处理
1.2.2.2 小鼠处理后的铁含量测定
1.2.2.3 不同铁水平小鼠感染H7N9流感病毒体重变化及死亡率检测
1.2.2.4 肺脏中病毒载量的测定
1.2.2.5 膳食铁处理小鼠感染H7N9流感病毒后免疫水平检测
1.2.3 右旋糖酐铁及地拉罗司在小鼠感染后的治疗效果
1.2.4 感染发生后铁代谢基因的变化
1.2.4.1 Bal B/C小鼠感染后肝、脾、肺中铁代谢基因的变化
1.2.4.2 A549细胞感染H7N9流感病毒后铁代谢基因的变化
1.3 实验结果
1.3.1 临床血清学检测
1.3.1.1 鸡胚扩增流感病毒红细胞凝集价测定
1.3.1.2 临床血清血凝抑制试验
1.3.1.3 各亚型抗体阳性与血清铁和ferritin关系
1.3.2 不同铁含量鼠粮对Bal B/C小鼠感染H7N9流感病毒的影响
1.3.2.1 饲喂处理后肝和血清铁含量
1.3.2.2 富铁、缺铁模型小鼠感染H7N9流感病毒体重变化和存活率
1.3.2.3 富铁、缺铁模型小鼠感染H7N9流感病毒肺脏病理变化
1.3.2.4 富铁、缺铁模型小鼠感染H7N9流感病毒肺脏免疫应答分析
1.3.2.5 脾脏、肺脏以及肺泡灌洗液全血中T细胞亚群
1.3.3 右旋糖酐铁及地拉罗司在小鼠感染后的治疗效果
1.3.3.1 小鼠体重变化及死亡率
1.3.3.2 给药后第7天与给药后第12天肝铁的含量
1.3.3.3 给药后第7天各组肺脏病理变化
1.3.3.4 给药后第7天各组肺脏组织中病毒蛋白NP转录水平检测
1.3.4 感染发生后铁代谢基因的变化
1.3.4.1 Bal B/C小鼠感染后各脏器中铁代谢基因变化
1.3.4.2 A549细胞感染H7N9流感病毒后铁代谢基因变化
1.4 讨论
第二章 Hfe敲除小鼠感染H7N9流感病毒
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物及实验材料
2.1.2 实验仪器
2.2 试验方法
+/+,hfe-/-死亡率及体重变化"> 2.2.1 Hfe+/+,hfe-/-死亡率及体重变化
2.2.2 感染后小鼠脏器的采集
2.2.3 感染后WT,KO小鼠免疫细胞水平检测
2.2.4 感染后小鼠脏器中细胞因子mRNA水平检测
2.2.5 感染后小鼠肺脏病理观察
2.2.6 不同铁含量饲料饲喂对KO小鼠感染H7N9流感病毒的影响
2.3 实验结果
2.3.1 WT,KO小鼠的体重变化及死亡率
2.3.2 WT,KO小鼠感染后肺脏病毒蛋白基因以及细胞因子水平
2.3.2.1 肺脏中病毒蛋白、细胞因子转录水平
2.3.2.2 血清及肺泡灌洗液中细胞因子水平
2.3.3 WT,KO小鼠感染后肺脏病理变化
2.3.4 脾脏、肺泡灌洗液（BALF）中免疫细胞水平
2.3.5 KO小鼠膳食铁处理感染H7N9流感病毒
2.4 讨论
第三章 HFE影响H7N9流感病毒感染机制研究
3.1 实验材料
3.1.1 生物材料及试剂
3.1.2 实验仪器
3.2 试验方法
3.2.1 HFE和MAVS载体构建
3.2.1.1 根据载体序列和HFE、MAVS序列进行引物设计
3.2.1.2 扩增HFE,MAVS片段
3.2.1.3 HFE与MAVS载体的构建
3.2.1.4 HFE与MAVS原核蛋白的表达及纯化
3.2.2 Western Blot分析HFE降解MAVS
3.2.2.1 293T细胞过表达3×Flag-MAVS与Myc-HFE
3.2.2.2 转染后细胞样品收集
3.2.2.3 SDS电泳样品制备并进行SDS电泳
3.2.2.4 蛋白转印
3.2.2.5 抗体孵育显色
3.2.3 免疫荧光检测MAVS与HFE定位关系
3.2.4 HFE与MAVS的相互作用
3.2.4.1 共转染HFE和MAVS的免疫共沉淀
+/+小鼠腹腔巨噬细胞中HFE和MAVS的免疫共沉淀"> 3.2.4.2 Hfe+/+小鼠腹腔巨噬细胞中HFE和MAVS的免疫共沉淀
3.2.4.3 HFE和MAVS的体外结合实验
3.2.5 腹腔巨噬细胞中HFE介导MAVS的降解
3.2.6 HFE介导MAVS降解机制探讨
+/+与hfe-/-BMDM细胞中MAVS的mRNA水平检测"> 3.2.6.1 Hfe+/+与hfe-/-BMDM细胞中MAVS的mRNA水平检测
3.2.6.2 HFE对MAVS的蛋白酶活性分析
3.2.6.3 HFE介导MAVS降解的通路探讨
3.3 实验结果
3.3.1 HFE与MAVS载体构建及原核表达
3.3.1.1 PCR扩增MAVS及HFE基因片段
3.3.1.2 MAVS及HFE的原核表达与纯化
3.3.2 293T细胞共转染3×Flag-MAVS与Myc-HFE
3.3.3 免疫荧光检测MAVS与HFE的定位
3.3.3.1 共聚焦显微观察MAVS与HFE及其突变体共定位情况
3.3.3.2 共聚焦显微观察MAVS及其突变体与HFE共定位情况
3.3.4 HFE与MAVS相互作用探讨
3.3.4.1 过表达的HFE与MAVS免疫共沉淀
3.3.4.2 腹腔巨噬细胞中HFE与MAVS的免疫共沉淀
3.3.4.3 HFE与MAVS的蛋白体外结合实验
+/+和hfe-/-小鼠腹腔巨噬细胞内MAVS的变化"> 3.3.5 Hfe+/+和hfe-/-小鼠腹腔巨噬细胞内MAVS的变化
3.3.6 HFE介导MAVS蛋白下调表达
3.3.6.1 WT和KO BMDM细胞中MAVS mRNA水平检测
3.3.6.2 HFE对MAVS的蛋白酶活性试验
3.3.6.3 化学小分子药物处理对HFE介导MAVS降解的影响
3.4 讨论
全文总结
展望
References
第三部分 附录
致谢
本文编号：3055717
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：156 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
论文创新点
摘要
Abstract
研究意义
技术路线
第一部分 文献综述
第一章 我国H7N9流感病毒的概况
1.1 人感染H7N9流感病毒的出现和流行
1.2 H7N9流感病毒的溯源
1.3 H7N9流感病毒的进化、传播和发展
第二章 流感病毒感染的先天免疫应答
2.1 先天免疫对流感病毒感染的识别
2.1.1 TLR介导的流感病毒感染的识别
2.1.2 RIG-I监视感染细胞内复制中的病毒RNA
2.1.3 NLRP3炎性体感知细胞的损伤
2.2 抗流感病毒的ISGs
2.3 疾病耐受性抗感染的机理
2.4 诱导适应性免疫的先天信号途径
第三章 铁代谢及其对病原感染时先天免疫应答的影响
3.1 全身铁代谢
3.2 铁蛋白对疾病的影响
3.2.1 铁调素
3.2.2 乳铁蛋白
3.2.3 噬铁蛋白
3.2.4 亚铁血红素铁因子
3.2.5 非亚铁血红素铁因子
3.3 铁代谢对病毒感染的影响
3.3.1 病毒靶定铁代谢中的蛋白
3.3.2 铁螯合剂的抗病毒作用
第四章 血色沉着病相关基因HFE的研究进展
4.1 Hfe基因的定位与克隆
4.2 Hfe基因结构
4.3 HFE蛋白结构,细胞和组织分布
4.3.1 HFE蛋白结构
4.3.2 HFE在细胞和组织中的分布
4.4 HFE功能
4.4.1 Hfe敲除
4.4.2 Hfe敲入
4.4.3 铁吸收
第二部分 研究内容
第一章 H7N9流感病毒感染与体内铁水平的关系
1.1 实验材料与设备
1.1.1 实验材料
1.1.2 实验仪器
1.2 试验方法
1.2.1 血清铁和血清Ferritin检测
1.2.1.1 血清的获取
1.2.1.2 鸡胚扩繁A型流感病毒PR8、H7N9毒株
1.2.1.3 血凝实验
1.2.1.4 血凝抑制（HI）实验
1.2.1.5 血清铁、ferritin检测
1.2.2 不同铁水平小鼠的H7N9流感病毒感染
1.2.2.1 Bal B/C小鼠预处理
1.2.2.2 小鼠处理后的铁含量测定
1.2.2.3 不同铁水平小鼠感染H7N9流感病毒体重变化及死亡率检测
1.2.2.4 肺脏中病毒载量的测定
1.2.2.5 膳食铁处理小鼠感染H7N9流感病毒后免疫水平检测
1.2.3 右旋糖酐铁及地拉罗司在小鼠感染后的治疗效果
1.2.4 感染发生后铁代谢基因的变化
1.2.4.1 Bal B/C小鼠感染后肝、脾、肺中铁代谢基因的变化
1.2.4.2 A549细胞感染H7N9流感病毒后铁代谢基因的变化
1.3 实验结果
1.3.1 临床血清学检测
1.3.1.1 鸡胚扩增流感病毒红细胞凝集价测定
1.3.1.2 临床血清血凝抑制试验
1.3.1.3 各亚型抗体阳性与血清铁和ferritin关系
1.3.2 不同铁含量鼠粮对Bal B/C小鼠感染H7N9流感病毒的影响
1.3.2.1 饲喂处理后肝和血清铁含量
1.3.2.2 富铁、缺铁模型小鼠感染H7N9流感病毒体重变化和存活率
1.3.2.3 富铁、缺铁模型小鼠感染H7N9流感病毒肺脏病理变化
1.3.2.4 富铁、缺铁模型小鼠感染H7N9流感病毒肺脏免疫应答分析
1.3.2.5 脾脏、肺脏以及肺泡灌洗液全血中T细胞亚群
1.3.3 右旋糖酐铁及地拉罗司在小鼠感染后的治疗效果
1.3.3.1 小鼠体重变化及死亡率
1.3.3.2 给药后第7天与给药后第12天肝铁的含量
1.3.3.3 给药后第7天各组肺脏病理变化
1.3.3.4 给药后第7天各组肺脏组织中病毒蛋白NP转录水平检测
1.3.4 感染发生后铁代谢基因的变化
1.3.4.1 Bal B/C小鼠感染后各脏器中铁代谢基因变化
1.3.4.2 A549细胞感染H7N9流感病毒后铁代谢基因变化
1.4 讨论
第二章 Hfe敲除小鼠感染H7N9流感病毒
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物及实验材料
2.1.2 实验仪器
2.2 试验方法
+/+,hfe-/-死亡率及体重变化"> 2.2.1 Hfe+/+,hfe-/-死亡率及体重变化
2.2.2 感染后小鼠脏器的采集
2.2.3 感染后WT,KO小鼠免疫细胞水平检测
2.2.4 感染后小鼠脏器中细胞因子mRNA水平检测
2.2.5 感染后小鼠肺脏病理观察
2.2.6 不同铁含量饲料饲喂对KO小鼠感染H7N9流感病毒的影响
2.3 实验结果
2.3.1 WT,KO小鼠的体重变化及死亡率
2.3.2 WT,KO小鼠感染后肺脏病毒蛋白基因以及细胞因子水平
2.3.2.1 肺脏中病毒蛋白、细胞因子转录水平
2.3.2.2 血清及肺泡灌洗液中细胞因子水平
2.3.3 WT,KO小鼠感染后肺脏病理变化
2.3.4 脾脏、肺泡灌洗液（BALF）中免疫细胞水平
2.3.5 KO小鼠膳食铁处理感染H7N9流感病毒
2.4 讨论
第三章 HFE影响H7N9流感病毒感染机制研究
3.1 实验材料
3.1.1 生物材料及试剂
3.1.2 实验仪器
3.2 试验方法
3.2.1 HFE和MAVS载体构建
3.2.1.1 根据载体序列和HFE、MAVS序列进行引物设计
3.2.1.2 扩增HFE,MAVS片段
3.2.1.3 HFE与MAVS载体的构建
3.2.1.4 HFE与MAVS原核蛋白的表达及纯化
3.2.2 Western Blot分析HFE降解MAVS
3.2.2.1 293T细胞过表达3×Flag-MAVS与Myc-HFE
3.2.2.2 转染后细胞样品收集
3.2.2.3 SDS电泳样品制备并进行SDS电泳
3.2.2.4 蛋白转印
3.2.2.5 抗体孵育显色
3.2.3 免疫荧光检测MAVS与HFE定位关系
3.2.4 HFE与MAVS的相互作用
3.2.4.1 共转染HFE和MAVS的免疫共沉淀
+/+小鼠腹腔巨噬细胞中HFE和MAVS的免疫共沉淀"> 3.2.4.2 Hfe+/+小鼠腹腔巨噬细胞中HFE和MAVS的免疫共沉淀
3.2.4.3 HFE和MAVS的体外结合实验
3.2.5 腹腔巨噬细胞中HFE介导MAVS的降解
3.2.6 HFE介导MAVS降解机制探讨
+/+与hfe-/-BMDM细胞中MAVS的mRNA水平检测"> 3.2.6.1 Hfe+/+与hfe-/-BMDM细胞中MAVS的mRNA水平检测
3.2.6.2 HFE对MAVS的蛋白酶活性分析
3.2.6.3 HFE介导MAVS降解的通路探讨
3.3 实验结果
3.3.1 HFE与MAVS载体构建及原核表达
3.3.1.1 PCR扩增MAVS及HFE基因片段
3.3.1.2 MAVS及HFE的原核表达与纯化
3.3.2 293T细胞共转染3×Flag-MAVS与Myc-HFE
3.3.3 免疫荧光检测MAVS与HFE的定位
3.3.3.1 共聚焦显微观察MAVS与HFE及其突变体共定位情况
3.3.3.2 共聚焦显微观察MAVS及其突变体与HFE共定位情况
3.3.4 HFE与MAVS相互作用探讨
3.3.4.1 过表达的HFE与MAVS免疫共沉淀
3.3.4.2 腹腔巨噬细胞中HFE与MAVS的免疫共沉淀
3.3.4.3 HFE与MAVS的蛋白体外结合实验
+/+和hfe-/-小鼠腹腔巨噬细胞内MAVS的变化"> 3.3.5 Hfe+/+和hfe-/-小鼠腹腔巨噬细胞内MAVS的变化
3.3.6 HFE介导MAVS蛋白下调表达
3.3.6.1 WT和KO BMDM细胞中MAVS mRNA水平检测
3.3.6.2 HFE对MAVS的蛋白酶活性试验
3.3.6.3 化学小分子药物处理对HFE介导MAVS降解的影响
3.4 讨论
全文总结
展望
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第三部分 附录
致谢
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