兔抗人MiR-338抗体制备与鉴定

发布时间：2021-03-28 01:22

　　目的制备兔抗人MiR-338分子多克隆抗体。方法 PCR法扩增出MiR-338基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21（DE3）、IPTG诱导重组蛋白的表达, Ni²⁺-NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、Western blot和免疫组织化学法检测抗体。结果成功构建了MiR-338原核表达载体pET28/MiR-338,高效表达并纯化MiR-338蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1:6400,Western blot显示该抗体能与MiR-338特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然的MiR-338。结论成功地制备了效价高、特异性较强兔抗人MiR-338抗体,为进一步建立MiR-338的ELISA检测方法和探讨MiR-338在卵巢癌的发生发展中所起的重要作用奠定了良好的基础。 

【文章来源】：九江学院学报(自然科学版). 2020,35(02)

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【部分图文】：

琼脂糖凝胶电泳分析KiSS- 1 RT-PCR 扩增产物

最佳诱导条件确定为在28℃条件加入的IPTG终浓度应为0.5mmol/L,最佳诱导时间为5h。诱导表达的MiR-338融合蛋白SDS-PAGE和westernblot鉴定结果,见图2。在Mr约52KD处有一条高表达的外源蛋白条带,与预测的目的蛋白的Mr相吻合,从500mL细菌培养液中纯化得到约3mg蛋白,经凝胶扫描分析显示,所得的蛋白纯度为93%,纯度较高。2.4抗血清的效价及特异性的鉴定

利用纯化的重组MiR-338为抗原,通过常规免疫家兔,获得兔抗人MiR-338抗体,ELISA检测效价其为1:6400,可用于对抗原进行检测。以制备的兔抗人MiR-338血清作一抗,进行Western blot检测,结果显示,诱导表达菌蛋白及纯化蛋白出现了特异反应条带,而在未加诱导剂的菌体蛋白中未见有反应条带,表明所制备的抗体与人MiR-338特异结合。应用所制备的抗体检测人卵巢癌组织石蜡切片,免疫组织化学染色结果显示,制备的抗体作为一抗有明显的阳性着色,每批染色均用已知阳性切片做阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照,以细胞质和/ 或细胞核内出现棕黄色颗料为阳性细胞。而应用正常家兔血清为一抗则无阳性着色(图3),说明所制备的兔抗人MiR-338抗体可特异识别天然状态下的MiR-338分子,抗体具有良好的活性和高特异性。3 讨论


本文编号：3104610