牛布鲁氏菌抗原蛋白的克隆表达及其刺激能力的评价
发布时间：2017-04-16 10:10
本文关键词：牛布鲁氏菌抗原蛋白的克隆表达及其刺激能力的评价，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患传染病。感染布病之后会累及多个器官的功能衰退,表现为流产和不孕不育等症状,且病程较长,难以治愈,严重者丧失劳动和生活能力。布病在世界各地的广泛流行,在给社会造成重大经济损失的同时也严重威胁着社会的健康安全,及时准确地诊断布病是防控布病的关键因素之一。常规的布病诊断方法利用LPS作为检测抗原,但由于布病疫苗的使用以及LPS与耶尔森菌等之间存在抗原结构相似性,布病的诊断容易出现假阳性和交叉反应,所以只有先进的实验室诊断方法才能准确诊断布病。本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达了rHis-L7/L12(基因名rplL)、rHis-Bp26、 rHis-GroEL、rHis-CuZn-SOD(基因名S、odl)、rHis-P39和rHis-Omp25等6种布鲁氏菌抗原蛋白,并使用其中的5种以可溶形式表达的重组蛋白及布鲁氏菌素(Br-PPD)进行牛布病外周血IFN-γ体外释放试验,以期望筛选出具有良好刺激效果的特异性IFN-γ刺激原,为进一步研究奠定基础。1、布鲁氏菌6种抗原蛋白的重组表达、纯化和鉴定根据目的基因序列设计引物,通过PCR扩增的方法获得rplL、groEL、bp26、omp25、p39和sod1目的片段,大小分别为375 bp、1641 bp、753 bp、642 bp、1206 bp和522 bp,将目的片段连接到载体并进行测序确认。将测序正确的目的片段转入表达载体,最终构建了pET-28a(+)-rplL、pCold Ⅰ-groEL、pCold Ⅰ-bp26、pCold Ⅰ-omp25、pCold Ⅰ-p39(?)pCold Ⅰ-sod1原核表达质粒,分别将6种重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE结果分析,分别出现预期的目的条带,大小分别为20 kDa、65 kDa、33 kDa、28 kDa、47 kDa和24 kDa,说明重组蛋白获得表达,其中rHis-L7/L12、rHis-GroEL rHis-Bp26、rHis-P39 和 rHis-CuZn-SOD以胞内可溶形式表达,rHis-Omp25为包涵体形式表达。通过His免疫亲和层析法进行蛋白的纯化,Western blot结果显示6种重组蛋白均能与His单抗发生特异性反应,表明6种重组蛋白获得成功表达。2、牛布鲁氏菌抗原蛋白的刺激能力评价使用本实验表达纯化的5种重组蛋白以及Br-PPD进行牛布病外周血IFN-y体外释放试验的检测。在临床样品的刺激实验中,以L7/L12为刺激原的IFN-γ释放试验与ELISA检测结果之间表现出最高的正相关性(Pearson's r0.6), 其次为Br-PPD(Pearson's r0.2)具有一定相关性,也表现出一定的刺激潜力；在5种重组蛋白以及Br-PPD进行的样品检测中,以L7/L12和Br-PPD为刺激原的IFN-γ体外释放试验与ELISA检测结果之间具有较高的符合率(总符合率均为89.0%),L7/L12的敏感性、特异性、阳性符合率和阴性符合率分别为50.0%,96.7%,75.0%和90.7%,表现出作为刺激原的潜能。Br-PPD的敏感性、特异性、阳性符合率和阴性符合率分别54.8%,94.1%,70.8%和88.9%,显示出良好的刺激能力。而其他4种重组蛋白则没有显示出较好的符合率。综上所述,在5种候选抗原和Br-PPD中,Br-PPD和L7/L12作为牛布病外周血IFN-y体外释放试验的刺激原具有明显优势,而Bp26、GroEL、P39和CuZn-SOD不具有作为刺激原的潜力。
【关键词】：布鲁氏菌病 原核表达 重组蛋白 IFN-γ 刺激原
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61;R378.5
【目录】：
- 中文摘要2-4
- 英文摘要4-7
- 符号说明7-9
- 综述9-22
- 1 布鲁氏菌病概述9
- 1.1 布鲁氏菌病病原及特征9
- 1.2 流行病学9
- 1.3 布鲁氏菌病疫情及危害9
- 2 牛布鲁氏菌病诊断的研究进展9-12
- 2.1 细菌学检查10
- 2.2 分子生物学诊断10-11
- 2.3 血清学方法11
- 2.4 布鲁氏菌素皮试试验11
- 2.5 抗原特异性的IFN-γ诊断方法11-12
- 3 诊断抗原研究进展12-16
- 3.1 外膜蛋白12-14
- 3.2 菌体蛋白14-15
- 3.3 其他蛋白15-16
- 4 总结16
- 参考文献16-22
- 第一章 布鲁氏菌6种抗原蛋白的重组表达、纯化和鉴定22-40
- 1 材料与方法22-29
- 1.1 材料22-23
- 1.2 方法23-29
- 2 结果29-37
- 2.1 目的基因扩增和重组质粒的鉴定29-32
- 2.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析32-36
- 2.3 重组蛋白的Western blot分析36-37
- 3 讨论37-38
- 参考文献38-40
- 第二章 牛布鲁氏菌抗原蛋白刺激能力的评价40-52
- 1 材料与方法40-42
- 1.1 材料40-41
- 1.2 方法41-42
- 2 结果42-47
- 3 讨论47-49
- 参考文献49-52
- 致谢52-53
- 攻读硕士期间发表的学术论文53-54
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2 孙天志 ,崔玉兰;用E玫瑰花环激活试验研究豚鼠实验性布病的疾病状态和康复趋势[J];中国地方病学杂志;1983年03期
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1 Q，
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