人类多能干细胞向脊髓前角运动神经元定向分化方法研究进展:从发育生物学到临床转化
发布时间：2021-03-30 16:41
人类多能干细胞（human pluripotent stem cell,hPSC）包括人胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）及人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）,它们具有向人体多种类型细胞分化的潜能。近年来,其体外定向分化为脊髓前角运动神经元的研究取得了一定进展。该文基于对神经发育的理解,回顾总结了hPSC向脊髓前角运动神经元定向分化的研究进展,并介绍了它们在研究人类神经发育、对疾病进行体外建模和细胞替代疗法方面的应用。
【文章来源】：中国细胞生物学学报. 2020,42(08)CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
中枢神经系统发育的前后轴模式化示意图(根据参考文献[2,9]修改)
最早对于脊髓运动神经元体外分化方法的探索是在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)中进行的[19]。以“活化–转化”学说为理论依据,mESC先后经历了神经诱导、后方化和腹侧化,分化为脊髓MN。其中神经诱导通过拟胚体(embryoid body,EB)步骤实现。EB是mESC在无白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的干细胞培养液中悬浮培养,自发聚集形成的细胞团。EB包含外、中、内三胚层命运的细胞,可在一定程度上模拟体内胚胎发育过程[20];第2～3天的EB中可检测到部分SOX1阳性的神经上皮细胞;在第5天,可检测到神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)、βIII微管蛋白(neuronal class III β-tubulin,TUJ1)双阳性的神经元。而后方化和腹侧化则分别通过添加RA和SHH激活剂实现。神经诱导–后方化–腹侧化这一策略随后被应用到人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的诱导分化中[8]。与mESC相似,早期研究多通过使用撤去成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)的hESC培养液悬浮培养hESC,得到EB[20];随后应用神经分化培养基(多含N2)培养EB,可得到PAX6阳性的神经上皮细胞,在贴壁培养条件下,神经上皮细胞呈环状排列,被称为神经玫瑰花结构(neural rosette),类似胚胎发育过程中的神经管。早期rosette为PAX6阳性、SOX1阴性;晚期rosette为PAX6、SOX1双阳性[21]。早期研究多经过EB-rosette阶段进行hESC的神经诱导,再挑取rosette,运用RA及SHH激活剂—包括SHH、hedgehog/smoothened激动剂(hedgehog/smoothened agonist,SAG)与PMN(purmorphamine)进行处理,实现后方化和腹侧化,得到MN。MN在含多种神经营养因子[包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)等]的培养液中逐渐成熟(图3),表达成熟神经元标志物微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)、NeuN及胆碱能标志物ChAT、VAChT,并可发放动作电位[21-23]。也有部分研究不经过EB阶段,而采用高密度贴壁培养的方法得到rosette[24-25];或不经rosette,在悬浮培养条件下进行神经诱导[26-27]。然而,由于人类发育过程相较小鼠而言十分缓慢,采用这一策略的各种分化方法均耗时较长(约1～2个月),且得到神经元的比例普遍偏低(20%～50%)[8]。
尽管SMAD双抑制剂的运用使得脊髓运动神经元体外分化的效率大大提高,但这一类方法只能将hPSC分化为后脑及脊髓前端运动神经元,表达同源盒基因家族靠3?端基因(图1),而更后方化的神经元—包括支配下肢肌肉的腰、骶段神经元则无法获得[8]。而神经中胚层前体细胞的发现为后方化脊髓的获得打开了新的途径。在鸡、小鼠及人类胚胎中,这一类细胞存在于上胚层的后外侧(caudal lateral epiblast,CLE)、毗邻原条–原节交界区(node-streak border,NSB)[4-6],表现为神经前体细胞标志物SOX2及中胚层前体标志物Brachury(Bra/T)双阳性,可发育为轴旁中胚层及后方化的脊髓[35-36]。目前已有多项研究在体外得到了神经中胚层前体细胞,发育早期Wnt信号通路的激活被认为对NMP的形成至关重要[36]。最早的研究描述了将以FGF-2及Activin维持培养的小鼠上胚层干细胞(epiblast stem cell,EpiSC)用CHIR处理48 h,可得到一小群Bra、SOX2双阳性细胞,同时大部分细胞为Bra、叉头样转录因子A2(forkhead box transcription factor A2,FOXA2)双阳性的中胚层前体细胞[37]。基因表达分析证实,CHIR导致了Wnt信号通路的激活。随后的研究将小鼠及人ESC暴露于FGF-2和CHIR,而不用Activin处理,可得到高达80%的Bra、SOX2双阳性细胞。其中将mESC用FGF-2处理2天可得到上胚层样的细胞,随后添加Wnt处理1天,可得到NMP[38]。诱导过程的第2～3天被认为是Wnt信号响应的窗口期[39]。而hESC的NMP体外诱导方式则与mESC略有不同,多采用FGF-2和CHIR联合处理3天的方式,CHIR在诱导的第0天开始添加直至第3天[2]。除此之外,有研究通过从第0天撤去FGF-2,在1～3天添加FGF8b,2～3天添加CHIR,可在第3天得到接近100%的NMP,并可在体外维持最多7天[40];亦有研究不添加FGF-2,而运用SB431542及CHIR处理hESC,在第4天得到了表达后方化神经标志物及中胚层标志物的“后方前体细胞”(caudal progenitor cell)[41]。
本文编号：3109809
【文章来源】：中国细胞生物学学报. 2020,42(08)CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
中枢神经系统发育的前后轴模式化示意图(根据参考文献[2,9]修改)
最早对于脊髓运动神经元体外分化方法的探索是在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)中进行的[19]。以“活化–转化”学说为理论依据,mESC先后经历了神经诱导、后方化和腹侧化,分化为脊髓MN。其中神经诱导通过拟胚体(embryoid body,EB)步骤实现。EB是mESC在无白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的干细胞培养液中悬浮培养,自发聚集形成的细胞团。EB包含外、中、内三胚层命运的细胞,可在一定程度上模拟体内胚胎发育过程[20];第2～3天的EB中可检测到部分SOX1阳性的神经上皮细胞;在第5天,可检测到神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)、βIII微管蛋白(neuronal class III β-tubulin,TUJ1)双阳性的神经元。而后方化和腹侧化则分别通过添加RA和SHH激活剂实现。神经诱导–后方化–腹侧化这一策略随后被应用到人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的诱导分化中[8]。与mESC相似,早期研究多通过使用撤去成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)的hESC培养液悬浮培养hESC,得到EB[20];随后应用神经分化培养基(多含N2)培养EB,可得到PAX6阳性的神经上皮细胞,在贴壁培养条件下,神经上皮细胞呈环状排列,被称为神经玫瑰花结构(neural rosette),类似胚胎发育过程中的神经管。早期rosette为PAX6阳性、SOX1阴性;晚期rosette为PAX6、SOX1双阳性[21]。早期研究多经过EB-rosette阶段进行hESC的神经诱导,再挑取rosette,运用RA及SHH激活剂—包括SHH、hedgehog/smoothened激动剂(hedgehog/smoothened agonist,SAG)与PMN(purmorphamine)进行处理,实现后方化和腹侧化,得到MN。MN在含多种神经营养因子[包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)等]的培养液中逐渐成熟(图3),表达成熟神经元标志物微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)、NeuN及胆碱能标志物ChAT、VAChT,并可发放动作电位[21-23]。也有部分研究不经过EB阶段,而采用高密度贴壁培养的方法得到rosette[24-25];或不经rosette,在悬浮培养条件下进行神经诱导[26-27]。然而,由于人类发育过程相较小鼠而言十分缓慢,采用这一策略的各种分化方法均耗时较长(约1～2个月),且得到神经元的比例普遍偏低(20%～50%)[8]。
尽管SMAD双抑制剂的运用使得脊髓运动神经元体外分化的效率大大提高,但这一类方法只能将hPSC分化为后脑及脊髓前端运动神经元,表达同源盒基因家族靠3?端基因(图1),而更后方化的神经元—包括支配下肢肌肉的腰、骶段神经元则无法获得[8]。而神经中胚层前体细胞的发现为后方化脊髓的获得打开了新的途径。在鸡、小鼠及人类胚胎中,这一类细胞存在于上胚层的后外侧(caudal lateral epiblast,CLE)、毗邻原条–原节交界区(node-streak border,NSB)[4-6],表现为神经前体细胞标志物SOX2及中胚层前体标志物Brachury(Bra/T)双阳性,可发育为轴旁中胚层及后方化的脊髓[35-36]。目前已有多项研究在体外得到了神经中胚层前体细胞,发育早期Wnt信号通路的激活被认为对NMP的形成至关重要[36]。最早的研究描述了将以FGF-2及Activin维持培养的小鼠上胚层干细胞(epiblast stem cell,EpiSC)用CHIR处理48 h,可得到一小群Bra、SOX2双阳性细胞,同时大部分细胞为Bra、叉头样转录因子A2(forkhead box transcription factor A2,FOXA2)双阳性的中胚层前体细胞[37]。基因表达分析证实,CHIR导致了Wnt信号通路的激活。随后的研究将小鼠及人ESC暴露于FGF-2和CHIR,而不用Activin处理,可得到高达80%的Bra、SOX2双阳性细胞。其中将mESC用FGF-2处理2天可得到上胚层样的细胞,随后添加Wnt处理1天,可得到NMP[38]。诱导过程的第2～3天被认为是Wnt信号响应的窗口期[39]。而hESC的NMP体外诱导方式则与mESC略有不同,多采用FGF-2和CHIR联合处理3天的方式,CHIR在诱导的第0天开始添加直至第3天[2]。除此之外,有研究通过从第0天撤去FGF-2,在1～3天添加FGF8b,2～3天添加CHIR,可在第3天得到接近100%的NMP,并可在体外维持最多7天[40];亦有研究不添加FGF-2,而运用SB431542及CHIR处理hESC,在第4天得到了表达后方化神经标志物及中胚层标志物的“后方前体细胞”(caudal progenitor cell)[41]。
本文编号：3109809
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