慢病毒介导siRNA抑制登革病毒复制的研究

发布时间：2021-04-09 14:59

　　目的探讨siRNA抑制登革病毒复制的分子机制。方法用登革病毒感染Vero细胞,实时荧光定量PCR检测稳定表达Si-DENV的Vero细胞系上清中病毒含量,并通过流式细胞技术检测感染细胞的比例,利用细胞免疫荧光法和Western blot方法检测登革病毒蛋白表达情况。结果 Si-DENV能够抑制登革病毒在细胞内的复制以及病毒释放,与对照组相比,感染后第3～7d,上清中病毒含量的差异均具有统计学意义（P<0.01）。感染后第7d,Si-DENV组登革病毒感染细胞的比例仅为4.48%,对照组感染细胞比例为81.06%。实时荧光RT-PCR结果表明Si-DENV组病毒基因组RNA及负链RNA含量显著减少,与Si-NC组相比差异具有统计学意义（P<0.01）,细胞免疫荧光法和Western blot实验证明Si-DENV下调prM、E、NS1等病毒蛋白在Vero细胞中的表达水平。结论利用慢病毒转染Si-DENV能抑制登革病毒在Vero细胞中的复制,为登革病毒的防治提供了新的思路。 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2020,15(04)北大核心CSCD

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

细胞上清中登革病毒含量的变化

采用共聚焦显微镜和流式细胞仪分析确定各组细胞的病毒感染比例。其中，共聚焦显微镜观察显示，在表达Si-DENV的细胞中DENV复制被显著抑制，只有少数细胞被DENV感染，而DENV对照组及Si-NC对照组>90%的细胞均能检测到登革病毒prM蛋白（图2A）。流式细胞术分析显示，Si-DENV组eGFP+/prM+细胞占4.48%,Si-NC组eGFP+/prM+细胞占81.06%，无siRNA组的eGFP-/prM+细胞占87.52%（图2B）。表明Si-DENV具有抑制登革病毒感染Vero细胞作用，即能抑制登革病毒的复制和释放。3 Si-DENV抑制DENV-1基因组RNA复制和负链RNA合成作用

通过实时荧光定量RT-PCR或定性PCR检测细胞中DENV-1基因组RNA和负链RNA的相对含量。用特异性引物分别扩增病毒基因组RNA及负链RNA，并以β-actin作为内参照标准。病毒RNA的相对含量见图3,Si-DENV组病毒基因组RNA及负链RNA相对含量分别为0.016±0.008、0.011±0.027,Si-NC组分别为1.165±0.017、1.129±0.073。SiDENV组与Si-NC组相比，病毒RNA相对含量的差异具有统计学意义（P<0.01），病毒基因组RNA及负链RNA的拷贝数均下降>95%,Si-NC组的RNA的拷贝数与DENV组的拷贝数相当。1%琼脂糖凝胶电泳同样证实，与其他组相比Si-DENV组病毒RNA合成显著减少。表明Si-DENV能抑制DENV-1基因组RNA和负链RNA的合成。4 Si-DENV对登革病毒蛋白表达的抑制作用

【参考文献】：
期刊论文
[1]表达登革病毒prM基因小干扰RNA的Vero细胞系的建立[J]. 李磊,吴新伟,伍业健,罗兰,蒋力云,杨霞.  中国生物化学与分子生物学报. 2011(11)



本文编号：3127828