稳定过表达CXCR2受体的HEK-293细胞株的构建以及活性鉴定
发布时间：2021-04-17 07:04
CXC趋化因子受体2（the CXC chemokine receptor 2,CXCR2）介导的中性粒细胞趋化在细菌感染、慢性炎症、肿瘤发生发展过程中发挥着至关重要的作用,但是目前对于CXCR2受体及下游信号的调控并未被完全揭示。该研究首先以Flag-CXCR2-Tango质粒为模板设计Flag-CXCR2的特异性引物,PCR扩增后将其连接至pCDH-MCS-T2A-Neo-MSCV慢病毒表达载体上,随后对阳性克隆进行测序及表达验证。接着在HEK-293T细胞中包装过表达Flag-CXCR2的慢病毒颗粒并感染HEK-293细胞,使用遗传霉素筛选后,蛋白质免疫印迹和免疫荧光检测发现,Flag-CXCR2稳定表达在HEK-293细胞膜上。最后利用白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）刺激过表达Flag-CXCR2的细胞株,检测发现CXCR2下游信号通路活化及F-actin组装。
【文章来源】：中国细胞生物学学报. 2020,42(08)CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
稳定过表达Flag-CXCR2的HEK-293细胞株的活性鉴定
CXCR2作为膜受体,在静息状态下定位于细胞膜。本实验将对照和表达Flag-CXCR2的细胞株进行免疫荧光检测。结果显示,稳定表达Flag-CXCR2受体的细胞株在细胞膜上能够明显看到绿光,而对照组则无绿光,这表明Flag-CXCR2蛋白成功定位细胞膜(图3B)。2.4 稳定过表达Flag-CXCR2的HEK-293细胞株的活性鉴定
CXCR2受体与配体结合后,一方面能够导致PI3K-AKT以及MAPK信号通路的活化,另一方面能够促使F-actin发生极化,为细胞运动做准备。本实验将对照和稳定过表达Flag-CXCR2的细胞株进行IL-8刺激。蛋白质免疫印迹检测发现,过表达Flag-CXCR2受体的细胞株中p-JNK、p-P38、p-AKT在IL-8刺激短时间内活化明显增强;但在刺激后15 min时,活化现象消失(图4A)。流式细胞仪检测发现,在IL-8刺激30 s时,过表达Flag-CXCR2受体细胞株F-actin瞬间发生极化且明显高于对照组,随着时间的增加,其F-actin极化逐渐减少,直到恢复到静息状态(图4B)。CXCR2是重要的趋化受体,能够响应IL-8的刺激,促使细胞发生趋化。本实验将对照和表达Flag-CXCR2的细胞株进行Transwell实验。结果显示,稳定表达Flag-CXCR2受体的细胞株趋化能力增强,发生趋化的细胞明显多于对照组,这表明Flag-CXCR2蛋白成功介导细胞趋化(图4C)。以上结果表明,稳定过表达Flag-CXCR2的HEK-293细胞株能够良好响应配体刺激。图3 HEK-293细胞株中Flag-CXCR2的表达与定位
【参考文献】：
期刊论文
[1]CXCR2蛋白在结肠腺癌组织中的表达及意义[J]. 刘鸿章,刘力,周超熙,李欣慧,侯敏,张刚,刘超,张涛,贾雄杰,林坤峰,刘晓锐,张爱民,赵继东,张香梅. 广东医学. 2019(23)
[2]IL-8及CXCR1、CXCR2在白内障晶状体上皮细胞中的表达及其意义[J]. 程丽娜,宋蔚,闫春妮. 现代医学. 2019(10)
[3]肌萎缩侧索硬化患者外周血中IL-8、CXCR1、CXCR2的表达及意义[J]. 苏丹丹,张勇,毕方方,肖波. 中国临床研究. 2019(10)
[4]CXCL8及其受体CXCR1、CXCR2在慢性乙肝中的表达及意义[J]. 刘欣燕,王宏飞. 基因组学与应用生物学. 2018(09)
[5]G蛋白偶联受体的探索之路—记2012年诺贝尔化学奖得主Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka[J]. 肖晗,张幼怡. 中国科学:生命科学. 2012(12)
本文编号：3143018
【文章来源】：中国细胞生物学学报. 2020,42(08)CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
稳定过表达Flag-CXCR2的HEK-293细胞株的活性鉴定
CXCR2作为膜受体,在静息状态下定位于细胞膜。本实验将对照和表达Flag-CXCR2的细胞株进行免疫荧光检测。结果显示,稳定表达Flag-CXCR2受体的细胞株在细胞膜上能够明显看到绿光,而对照组则无绿光,这表明Flag-CXCR2蛋白成功定位细胞膜(图3B)。2.4 稳定过表达Flag-CXCR2的HEK-293细胞株的活性鉴定
CXCR2受体与配体结合后,一方面能够导致PI3K-AKT以及MAPK信号通路的活化,另一方面能够促使F-actin发生极化,为细胞运动做准备。本实验将对照和稳定过表达Flag-CXCR2的细胞株进行IL-8刺激。蛋白质免疫印迹检测发现,过表达Flag-CXCR2受体的细胞株中p-JNK、p-P38、p-AKT在IL-8刺激短时间内活化明显增强;但在刺激后15 min时,活化现象消失(图4A)。流式细胞仪检测发现,在IL-8刺激30 s时,过表达Flag-CXCR2受体细胞株F-actin瞬间发生极化且明显高于对照组,随着时间的增加,其F-actin极化逐渐减少,直到恢复到静息状态(图4B)。CXCR2是重要的趋化受体,能够响应IL-8的刺激,促使细胞发生趋化。本实验将对照和表达Flag-CXCR2的细胞株进行Transwell实验。结果显示,稳定表达Flag-CXCR2受体的细胞株趋化能力增强,发生趋化的细胞明显多于对照组,这表明Flag-CXCR2蛋白成功介导细胞趋化(图4C)。以上结果表明,稳定过表达Flag-CXCR2的HEK-293细胞株能够良好响应配体刺激。图3 HEK-293细胞株中Flag-CXCR2的表达与定位
【参考文献】：
期刊论文
[1]CXCR2蛋白在结肠腺癌组织中的表达及意义[J]. 刘鸿章,刘力,周超熙,李欣慧,侯敏,张刚,刘超,张涛,贾雄杰,林坤峰,刘晓锐,张爱民,赵继东,张香梅. 广东医学. 2019(23)
[2]IL-8及CXCR1、CXCR2在白内障晶状体上皮细胞中的表达及其意义[J]. 程丽娜,宋蔚,闫春妮. 现代医学. 2019(10)
[3]肌萎缩侧索硬化患者外周血中IL-8、CXCR1、CXCR2的表达及意义[J]. 苏丹丹,张勇,毕方方,肖波. 中国临床研究. 2019(10)
[4]CXCL8及其受体CXCR1、CXCR2在慢性乙肝中的表达及意义[J]. 刘欣燕,王宏飞. 基因组学与应用生物学. 2018(09)
[5]G蛋白偶联受体的探索之路—记2012年诺贝尔化学奖得主Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka[J]. 肖晗,张幼怡. 中国科学:生命科学. 2012(12)
本文编号：3143018
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