Wnt/β-catenin信号调控毛囊干细胞和微环境建立机制的研究
发布时间：2021-04-20 10:06
成体干细胞维持组织和器官的再生过程。这群细胞位于器官中的特定位置,在生物体整个生命周期中维持自我更新并保持多能性,主导组织再生和创伤修复过程。成体干细胞起源于发育早期的原始细胞,在发育过程中逐渐获得长期的自我更新和多能性特征,并在发育末期器官形成时正式建立,但这一建立过程的调控机制并不清楚。毛囊是人类具有高度再生功能的组织,位于囊突（Bulge）区域的毛囊干细胞主导毛发的再生过程。之前的研究表明,毛囊干细胞前体细胞在成体器官形成前就已经出现,并具有一定的成体干细胞功能。但并不知道这一过程是如何实现的。我们发现毛囊干细胞的命运在毛囊发育早期毛栓期（HairPeg）就已经被决定。谱系追踪实验证明毛囊干细胞起源于一群在毛栓高位的前体细胞,这群细胞可以形成超过70%的毛囊干细胞。为了探索毛囊干细胞在细胞建立过程中的命运决定因素,我建立小鼠表皮活体成像与激光灼杀实验系统,对高位毛栓细胞进行激光灼杀,实验结果显示,在前体细胞被灼杀后,毛囊bulge结构和其中的成体干细胞仍然能够形成,毛囊仍然具有再生功能,这说明毛囊干细胞前体细胞所处的微环境（Niche）是干细胞建立的决定因素。为探索微环境调控毛囊...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词表
第一章 文献综述
1.1 毛囊的再生
1.1.1 毛囊的组成结构
1.1.2 毛囊的周期性生长
1.2 毛囊干细胞
1.2.1 毛囊干细胞的特点
1.2.2 毛囊干细胞的标记物基因
1.2.3 毛囊干细胞参与毛囊再生过程
1.2.4 毛囊干细胞的分子调控机制
1.3 毛囊干细胞的微环境（Niche）
1.3.1 Niche中的真皮细胞
1.3.2 Niche中的干细胞子代细胞
1.3.3 Niche中的神经细胞
1.3.4 Niche中的血管
1.3.5 Niche中的立毛肌细胞
1.3.6 Niche中的黑色素细胞
1.4 Wnt/β-catenin信号通路
1.4.1 Wnt/β-catenin信号的分子生物学机制
1.4.2 Wnt信号参与表皮器官发育过程
1.4.3 Wnt信号参与毛囊的发育过程
1.5 毛囊干细胞的建立过程
1.5.1 毛囊的形态发生
1.5.2 毛囊的形态发生过程中的信号调控
1.5.3 毛囊干细胞标记物早期的表达和功能
1.5.4 毛囊干细胞早期的建立
1.6 研究目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 野生型小鼠材料
2.1.2 转基因小鼠材料
2.2 常规试剂
2.2.1 PCR相关试剂
2.2.2 RNA提取相关试剂
2.2.3 反转录与定量PCR相关试剂
2.2.4 免疫组织化学实验相关试剂
2.2.5 小鼠实验相关试剂
2.2.6 流式细胞分选相关试剂
2.2.7 其它相关试剂
2.3 实验抗体
2.3.1 实验所用一抗
2.3.2 实验所用二抗
2.4 相关试剂配制
2.4.1 PBS缓冲液
2.4.2 4%多聚甲醛
2.4.3 EDTA的配制（20 mM,pH 8.0）
2.4.4 DAPI染液
2.4.5 他莫昔芬的配制（10 mg/mL）
2.4.6 封闭液的配制
2.4.7 苏木精染液的配制
2.4.8 伊红染液的配制
2.4.9 油红O染液的配制
2.4.10 4%中性缓冲液福尔马林缓冲液的配制
2.4.11 麻醉剂的配制
2.5 主要仪器设备
2.5.1 显微镜
2.5.2 组织学实验相关仪器
2.5.3 流式细胞分选相关仪器
2.5.4 分子生物学相关仪器
2.5.5 其它仪器
2.6 分析软件
2.7 实验方法
2.7.1 谱系追踪实验
2.7.2 小鼠皮肤双光子活体成像实验
2.7.3 小鼠皮肤双光子激光灼杀实验
2.7.4 流式细胞仪分选高位毛栓细胞
2.7.5 流式细胞仪分选低位毛栓细胞
2.7.6 流式细胞仪分选成年小鼠毛囊干细胞
2.7.7 细胞RNA提取实验
2.7.8 反转录
2.7.9 荧光定量PCR
2.7.10 条件性基因敲除小鼠的杂交和给药处理
2.7.11 制作小鼠皮肤组织石蜡切片
2.7.12 石蜡切片HE染色
2.7.13 石蜡切片的免疫组织化学染色
2.7.14 小鼠皮肤组织冰冻切片的免疫荧光染色
2.7.15 小鼠皮肤表皮全组织HE和Oil Red O染色
2.7.16 小鼠皮肤表皮全组织的免疫荧光染色
2.7.17 RNAscope原位杂交实验
2.7.18 图像的拍摄及处理
2.7.19 小鼠基因型鉴定实验
2.7.20 细胞基因组的提取实验
第三章 实验结果与分析
3.1 毛囊干细胞在胚胎期的起源
3.1.1 谱系追踪实验小鼠模型
3.1.2 小鼠背部和尾部皮肤毛囊发育模式特征
3.1.3 谱系追踪实验探索毛囊干细胞的起源
3.2 发育早期微环境影响毛囊干细胞的建立
3.2.1 高位毛栓细胞激光灼杀实验小鼠模型
3.2.2 激光灼杀实验能有效地杀死毛囊干细胞前体细胞
3.2.3 被激光灼杀的前体细胞被临近细胞取代形成新的干细胞
3.2.4 新形成的毛囊干细胞具有再生功能
3.3 高位和低位毛栓细胞的转录谱特征分析和验证
3.3.1 流式细胞分离技术分选高位和低位毛栓细胞
3.3.2 高通量RNA-seq分析两种毛栓细胞的转录谱特征
3.3.3 Real-time PCR验证Wnt/β-catenin信号在两种毛栓细胞中的表达差异
3.3.4 原位杂交实验验证Wnt/β-catenin信号在两种毛栓细胞中的表达和响应差异
3.3.5 Top-Gal转基因小鼠检测Wnt/β-catenin信号在毛囊发育早期细胞中的响应
3.3.6 谱系追踪实验探索响应Wnt/β-catenin信号的细胞命运
3.3.7 Shh/Gli1信号在毛栓细胞中的响应情况
3.3.8 BMP/Id2信号在毛栓细胞中的响应情况
3.4 Wnt/β-catenin信号对毛囊干细胞建立的影响
3.4.1 激活Wnt/β-catenin信号的小鼠模型
3.4.2 高位细胞中的Wnt/β-catenin信号激活影响毛囊干细胞的建立
3.4.3 Wnt/β-catenin信号激活对Sox9蛋白的表达情况的影响
3.4.4 Wnt/β-catenin信号对Sox9的抑制作用
3.4.5 发育早期Wnt/β-catenin信号的激活影响毛囊干细胞的长期自我更新
第四章 讨论
4.1 毛囊干细胞在胚胎期的起源
4.2 Wnt/β-catenin信号在毛囊干细胞建立过程中的动态变化
4.3 毛囊干细胞建立的分子调控机制
4.4 毛栓期Wnt/β-catenin信号隔离区的建立机制
第五章 结论
参考文献
致谢
附录 实验用抗体列表和引物列表
作者简历
本文编号：3149480
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词表
第一章 文献综述
1.1 毛囊的再生
1.1.1 毛囊的组成结构
1.1.2 毛囊的周期性生长
1.2 毛囊干细胞
1.2.1 毛囊干细胞的特点
1.2.2 毛囊干细胞的标记物基因
1.2.3 毛囊干细胞参与毛囊再生过程
1.2.4 毛囊干细胞的分子调控机制
1.3 毛囊干细胞的微环境（Niche）
1.3.1 Niche中的真皮细胞
1.3.2 Niche中的干细胞子代细胞
1.3.3 Niche中的神经细胞
1.3.4 Niche中的血管
1.3.5 Niche中的立毛肌细胞
1.3.6 Niche中的黑色素细胞
1.4 Wnt/β-catenin信号通路
1.4.1 Wnt/β-catenin信号的分子生物学机制
1.4.2 Wnt信号参与表皮器官发育过程
1.4.3 Wnt信号参与毛囊的发育过程
1.5 毛囊干细胞的建立过程
1.5.1 毛囊的形态发生
1.5.2 毛囊的形态发生过程中的信号调控
1.5.3 毛囊干细胞标记物早期的表达和功能
1.5.4 毛囊干细胞早期的建立
1.6 研究目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 野生型小鼠材料
2.1.2 转基因小鼠材料
2.2 常规试剂
2.2.1 PCR相关试剂
2.2.2 RNA提取相关试剂
2.2.3 反转录与定量PCR相关试剂
2.2.4 免疫组织化学实验相关试剂
2.2.5 小鼠实验相关试剂
2.2.6 流式细胞分选相关试剂
2.2.7 其它相关试剂
2.3 实验抗体
2.3.1 实验所用一抗
2.3.2 实验所用二抗
2.4 相关试剂配制
2.4.1 PBS缓冲液
2.4.2 4%多聚甲醛
2.4.3 EDTA的配制（20 mM,pH 8.0）
2.4.4 DAPI染液
2.4.5 他莫昔芬的配制（10 mg/mL）
2.4.6 封闭液的配制
2.4.7 苏木精染液的配制
2.4.8 伊红染液的配制
2.4.9 油红O染液的配制
2.4.10 4%中性缓冲液福尔马林缓冲液的配制
2.4.11 麻醉剂的配制
2.5 主要仪器设备
2.5.1 显微镜
2.5.2 组织学实验相关仪器
2.5.3 流式细胞分选相关仪器
2.5.4 分子生物学相关仪器
2.5.5 其它仪器
2.6 分析软件
2.7 实验方法
2.7.1 谱系追踪实验
2.7.2 小鼠皮肤双光子活体成像实验
2.7.3 小鼠皮肤双光子激光灼杀实验
2.7.4 流式细胞仪分选高位毛栓细胞
2.7.5 流式细胞仪分选低位毛栓细胞
2.7.6 流式细胞仪分选成年小鼠毛囊干细胞
2.7.7 细胞RNA提取实验
2.7.8 反转录
2.7.9 荧光定量PCR
2.7.10 条件性基因敲除小鼠的杂交和给药处理
2.7.11 制作小鼠皮肤组织石蜡切片
2.7.12 石蜡切片HE染色
2.7.13 石蜡切片的免疫组织化学染色
2.7.14 小鼠皮肤组织冰冻切片的免疫荧光染色
2.7.15 小鼠皮肤表皮全组织HE和Oil Red O染色
2.7.16 小鼠皮肤表皮全组织的免疫荧光染色
2.7.17 RNAscope原位杂交实验
2.7.18 图像的拍摄及处理
2.7.19 小鼠基因型鉴定实验
2.7.20 细胞基因组的提取实验
第三章 实验结果与分析
3.1 毛囊干细胞在胚胎期的起源
3.1.1 谱系追踪实验小鼠模型
3.1.2 小鼠背部和尾部皮肤毛囊发育模式特征
3.1.3 谱系追踪实验探索毛囊干细胞的起源
3.2 发育早期微环境影响毛囊干细胞的建立
3.2.1 高位毛栓细胞激光灼杀实验小鼠模型
3.2.2 激光灼杀实验能有效地杀死毛囊干细胞前体细胞
3.2.3 被激光灼杀的前体细胞被临近细胞取代形成新的干细胞
3.2.4 新形成的毛囊干细胞具有再生功能
3.3 高位和低位毛栓细胞的转录谱特征分析和验证
3.3.1 流式细胞分离技术分选高位和低位毛栓细胞
3.3.2 高通量RNA-seq分析两种毛栓细胞的转录谱特征
3.3.3 Real-time PCR验证Wnt/β-catenin信号在两种毛栓细胞中的表达差异
3.3.4 原位杂交实验验证Wnt/β-catenin信号在两种毛栓细胞中的表达和响应差异
3.3.5 Top-Gal转基因小鼠检测Wnt/β-catenin信号在毛囊发育早期细胞中的响应
3.3.6 谱系追踪实验探索响应Wnt/β-catenin信号的细胞命运
3.3.7 Shh/Gli1信号在毛栓细胞中的响应情况
3.3.8 BMP/Id2信号在毛栓细胞中的响应情况
3.4 Wnt/β-catenin信号对毛囊干细胞建立的影响
3.4.1 激活Wnt/β-catenin信号的小鼠模型
3.4.2 高位细胞中的Wnt/β-catenin信号激活影响毛囊干细胞的建立
3.4.3 Wnt/β-catenin信号激活对Sox9蛋白的表达情况的影响
3.4.4 Wnt/β-catenin信号对Sox9的抑制作用
3.4.5 发育早期Wnt/β-catenin信号的激活影响毛囊干细胞的长期自我更新
第四章 讨论
4.1 毛囊干细胞在胚胎期的起源
4.2 Wnt/β-catenin信号在毛囊干细胞建立过程中的动态变化
4.3 毛囊干细胞建立的分子调控机制
4.4 毛栓期Wnt/β-catenin信号隔离区的建立机制
第五章 结论
参考文献
致谢
附录 实验用抗体列表和引物列表
作者简历
本文编号：3149480
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