利用不同方法对大鼠胚胎干细胞转染红色荧光蛋白表达载体的研究

发布时间：2017-04-19 09:05

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【摘要】：2008年Mia Buehr和Ping Li等成功建立了大鼠胚胎干细胞(Rat embryonic stem cells,r ESCs)系,为干细胞研究领域提供了一个全新的研究模型。大鼠因其独特的物种属性及其在心血管系统和神经系统等特殊疾病的研究领域的独特优势,一直以来被广泛应用于生物学和医学等自然科学研究领域。而r ESCs的出现为建立基因修饰的大鼠动物模型提供了更优质的实验材料,对大鼠转基因研究方法的改进起到关键作用。然而,对r ESCs进行有效的遗传操作是生产基因修饰的大鼠动物模型的基础。本实验通过将红色荧光蛋白表达载体导入r ESCs,寻找最优的r ESCs转基因方法,为建立基因修饰的大鼠动物模型提供新的思路和方法,从而为r ESCs在干细胞研究和异种移植等领域的应用奠定基础。目的本实验以大鼠胚胎干细胞(r ESCs)为研究对象,通过比较利用脂质体转染、电穿孔转染及核转染等转染技术将表达红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)的p EF1alpha-Ds Red-Express2 Vector质粒载体导入r ESCs,并比较不同转染技术的转基因效率,以期寻找更好的r ESCs转基因方法,并探讨转基因过程对r ESCs干细胞特性是否产生影响。方法利用脂质体法、电穿孔法和核转染法等转染方法将表达红色荧光蛋白(RFP)的p EF1alpha-Ds Red-Express2 Vector质粒载体导入r ESCs中,转染后即运用台盼蓝进行染色,统计转染后r ESCs的细胞存活率;并于48 h后观察r ESCs内红荧光蛋白表达情况,从而比较不同转染技术之间的转染效率差异,确定效率最佳的转染技术和转染条件。然后,运用碱性磷酸酶染色(AP)、反转录PCR(RTPCR)和免疫荧光染色等方法对转染前后的r ESCs进行干细胞特性方面的检测,探讨转基因过程对r ESCs干细胞特性的影响。结果在本实验采取的几种转染方法中,核转染技术能获得较高的转染效率;且在核转染条件为A13时,可获得最高的r ESCs红荧光蛋白转染效率,为(39.63±1.75)%,且核转染后r ESCs的细胞死亡率为(51.17±10.40)%。经过基因转染,r ESCs的碱性磷酸酶染色结果仍为阳性;同时,RT-PCR和免疫荧光染色结果表明核转染前后r ESCs内的Oct4,Nanog,Sox2等细胞多能性基因的表达均没有出现明显差异。结论相较于脂质体法和电穿孔法,核转染技术更适用于r ESCs的基因修饰,且核转染过程对r ESCs的干细胞特性无明显影响。
【关键词】：大鼠胚胎干细胞 红色荧光蛋白 转染效率 干细胞多能性标志基因
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321
【目录】：

• 全文主要缩略语4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-13
• 材料与方法13-34
• 结果34-42
• 讨论42-49
• 结论49-50
• 参考文献50-56
• 综述56-69
• 参考文献64-69
• 攻读学位期间发表文章情况及科研工作情况69-70
• 致谢70-71

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本文编号：315913