SCF信号对肥大细胞IL-13的产生及迁移性的影响

发布时间：2017-04-19 08:43

  本文关键词：SCF信号对肥大细胞IL-13的产生及迁移性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:肥大细胞起源于骨髓造血干细胞,其前体细胞在组织中进一步发育成熟[1]。肥大细胞一方面可作为效应细胞在变态反应中起作用,另一方面也可通过表达协同刺激分子和分泌细胞因子来调节体内多种生物学过程。肥大细胞表面FcεRⅠ的交联反应引发组胺等炎症介质的释放,从而介导过敏反应的早期相。更为重要的是,激活的肥大细胞可通过合成和释放嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-8等趋化因子,募集嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等到达组织局部,参与过敏反应的晚期相反应。干细胞因子(Stem Cell Factors,SCF)也称为肥大细胞生长因子。它来源于成纤维细胞、上皮细胞、嗜酸性粒细胞和气道平滑肌细胞等多种细胞。SCF是体内重要的生长因子,可以促进造血前体细胞、黑色素细胞和生殖细胞等多种细胞的增生、迁移、存活和分化。SCF信号对于肥大细胞的生长、存活、粘附、激活等生物学活性也具有重要作用。但有研究表明哮喘患者血清和痰液中SCF含量升高,但SCF与哮喘发病之间的关系不清[2-3]。支气管哮喘(简称哮喘)是常见的慢性呼吸道疾病之一,其发病率近年呈上升趋势[4]。哮喘是一种多种细胞(包括嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,肥大细胞和T淋巴细胞等)参与的慢性气道炎症,以气道高反应性和气道重塑为主要特征。有证据显示哮喘症状的严重性与气道中肥大细胞积聚的数量及其活化的程度相关。哮喘的发病与Th2型细胞因子IL-13有密切联系已为我们所熟知[5]。IL-13主要由活化的T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞等细胞产生。其可通过促进成肌纤维细胞的生成、胶原的沉积[6]以及气道上皮细胞的化生[7]而介导气道高反应性和气道重塑[8]的形成。最近的研究表明SCF与过敏原介导的气道重塑[9]相关,但详细的机制不清。由于肥大细胞在哮喘的发生和发展中均起到重要作用,因此为了说明SCF与哮喘发病之间的关系,有必要探讨SCF信号对肥大细胞IL-13的产生及迁移性的影响。目的:研究SCF信号对肥大细胞P815 IL-13的产生及迁移性的影响。方法:1.采用流式细胞术(FCM)和Western blot检测肥大细胞P815 c-Kit受体的表达。2.酶联免疫吸附测定(ELISA)检测不同浓度(1-100ng/ml)SCF刺激P815细胞不同时间(6h,12h,24h,48h,72h)后,IL-13的产生情况。3.分别使用MEK/ERK通路抑制剂U0126(10μM)、JAK/STAT3通路抑制剂JSI-124(100n M)、PI3K/Akt通路抑制剂Wortmannin(1μM)、CREB阻断剂H-89(20μM)、NF-κB阻断剂PDTC(50μM)预处理P815细胞30min后,再用SCF(50ng/ml)刺激6h,ELISA检测P815细胞IL-13产生的情况。4.Western blot检测肥大细胞P815在SCF(50ng/ml)刺激不同时间(0min,15min,30min,60min)后,信号通路蛋白Erk磷酸化情况。5.电泳迁移率滞后试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测肥大细胞P815在SCF(50ng/ml)刺激1h后,核转录因子CREB的活化情况。6.收集SCF(50ng/ml)刺激6h后P815细胞,进行荧光定量PCR,检测可以结合到IL-13 3’-UTR区mi RNAs(mi R-200c、mi R-194、mi R-34b-5p、mi R-449b、mi R-200b、mi R-362-3p、mi R-98、mi R-410、mi R-429、mi R-34a、mi R-34c及mi R-449c)的表达情况。7.Transwell细胞迁移实验,观察肥大细胞P815在SCF(10ng/ml)单独刺激或者先用Anti-CCL2(1ng/ml)抗体或者先用CCL2同型对照抗体(1ng/ml)预处理2h,再用SCF(10ng/ml)刺激后迁移细胞数的情况。结果:1.肥大细胞P815中存在c-Kit的表达,几乎所有肥大细胞P815细胞膜表面存在c-Kit受体的表达。2.不同浓度的SCF(1-100ng/ml)刺激P815细胞6h均可促进其产生IL-13(p0.01),以10-50ng/ml效果最为明显。50ng/ml的SCF作用于P815细胞不同时间(6h,12h,24h,48h,72h),IL-13产生明显升高(p0.01)。另外,SCF(50ng/ml)刺激P815细胞6h,IL-6分泌也增加(p0.05),而IFN-γ和IL-10分泌降低(p0.05)。3.与SCF单刺激组相比,JSI-124+SCF组、Wortmannin+SCF组和PDTC+SCF组IL-13的产生无明显差异,而U0126+SCF组和H-89+SCF组IL-13的产生明显降低(p0.01);4.P815细胞未刺激组磷酸化Erk1/2条带较弱,而SCF(50ng/ml)刺激15min后磷酸化Erk1/2条带亮度有所增加,30min达到高峰,60min呈现降低趋势。5.未刺激组CREB滞后带较弱,而SCF(50ng/ml)刺激P815细胞1h后出现明显的CREB滞后带。6.SCF(50ng/ml)刺激肥大细胞P815 6h后,mi R-200c、mi R-34b-5p及mi R-449b的表达升高,mi R-200b、mi R-362-3p、mi R-98、mi R-410、mi R-429、mi R-34a、mi R-34c、mi R-449c及mi R-362-3p的表达降低,其中以mi R-449c的降低最为明显。7.与未刺激组相比,SCF(10ng/ml)刺激P815细胞不同时间(3h,6h,12h,24h)后迁移细胞数均明显增多(p0.01)。与SCF(10ng/ml)单刺激组相比,Anti-CCL2+SCF(10ng/ml)组P815迁移细胞数明显降低(p0.01)。结论:1.几乎所有肥大细胞P815细胞膜表面存在c-Kit受体的表达。2.SCF通过启动MEK-ERK-CREB信号通路诱导肥大细胞P815产生IL-13。3.SCF能够加快P815细胞的迁移,并且此作用与CCL2相关。
【关键词】：干细胞因子 P815细胞 c-Kit 白介素-13 趋化因子配体2 MEK-ERK-CREB信号 细胞迁移
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 引言12-14
• 材料和方法14-22
• 结果22-34
• 讨论34-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 致谢47-48
• 附录48-62
• 附录A 英文缩略词表48-50
• 附录B 常用试剂配制50-52
• 附录C 个人简历及发表论文52-53
• 附录D 综述53-62
• 参考文献59-62

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