TLR配体为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病的调节作用

发布时间：2017-04-20 12:08

  本文关键词：TLR配体为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病的调节作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿、老年人以及免疫缺陷者下呼吸道感染的重要病原,甚至会造成死亡。但是由于疫苗的安全性问题,至今没有安全有效的疫苗批准上市。RSV疫苗增强性免疫病理反应的发病机制是研究疫苗的关键。TLR配体作为佐剂可能通过调节疫苗诱导的免疫应答类型,从而减轻或抑制疫苗增强性免疫病理。本研究选择了Pam Cys3(TLR-2的配体)、poly(I:C)(TLR-3的配体)、LPS(TLR-4的配体)、Cp G(TLR-9的配体)为佐剂,与FI-RSV疫苗共同免疫野生型C57BL/6小鼠,并用FI-RSV+Al(OH)3免疫My D88-/-C57 BL/6小鼠作为对照组之一,研究TLR配体为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病的调节作用。方法:1在Hep-2细胞上培养RSV,测定RSV滴度。2制备福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)和对照组疫苗(FI-control)。3动物实验3.1小鼠免疫分别用FI-control,FI-RSV,FI-RSV+Cp G2216,FI-RSV+Al(OH)3,FI-RSV+poly(I:C),FI-RSV+Pam Cys3,FI-RSV+LPS免疫野生型C57 BL/6小鼠,用FI-RSV+Al(OH)3免疫My D88-/-小鼠(C57BL/6背景),正常对照组用PBS免疫。肌肉注射免疫2次,每次间隔2周。3.2体液免疫检测末次免疫后14天小鼠尾静脉取血,分离血清,用ELISA检测抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a水平。3.3末次免疫4周后用RSV攻击被免疫小鼠,每天称取攻毒小鼠的体重,观察体重变化。3.4攻毒后5天,处死小鼠,取肺组织、支气管、肺冲洗液、肺匀浆,做相应检测3.4.1肺组织病理切片,HE染色,观察炎症浸润情况;PAS染色,观察气道粘液分泌情况;3.4.2支气管、肺冲洗液取支气管、肺冲洗液中的细胞,瑞氏-吉姆萨染色计数炎性细胞;3.4.3肺匀浆上清用空斑形成实验滴定病毒滴度;3.4.4血清中和抗体测定用空斑减少实验测中和抗体滴度;3.4.5 ELISA检测肺冲洗上清中细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IL-1β的含量;3.4.6实时定量PCR检测肺组织中IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、T-bet、Gata-3、ROR-γt、IFN-γ、RSV-N的m RNA表达。结果:1培养出RSV,并测定病毒滴度107.9 pfu/ml。2成功制备福尔马林灭活的疫苗(FI-RSV)和对照疫苗(FI-control)。3 ELISA间接法检测小鼠血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平。3.1 Ig GControl组没有Ig G产生,FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+LPS组Ig G含量显著高于FI-control组(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+LPS组Ig G含量显著高于FI-RSV组(P0.05),FI-RSV+LPS组产生Ig G抗体水平显著高于各佐剂组(P0.05)。3.2 Ig G1Control组、FI-RSV+Pamcys3组和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组无Ig G1产生,FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+LPS组Ig G1含量显著高于FI-control组、FI-RSV组(P0.05),FI-control组和FI-RSV组无显著性差异(P0.05)。3.3 Ig G2aControl组、FI-control组、FI-RSV+Pamcys3组和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组无Ig G2a产生,FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+LPS组与FI-RSV组Ig G2a产生水平无显著差异(P0.05)。3.4 Ig G1/Ig G2aFI-RSV+LPS组(0.83)与FI-RSV组(0.96)相比Ig G1/Ig G2a的比值降低,FI-RSV+Cp G组(1.1)、FI-RSV+Al(OH)3组(1.24)、FI-RSV+poly(I:C)组(1.26)与FI-RSV组(0.96)相比Ig G1/Ig G2a的比值升高。4中和抗体Control组无中和抗体产生,FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Pamcys3组产生的中和抗体水平显著高于FI-control组(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组和FI-control组无显著性差异(P0.05),FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Pamcys3组之间抗体滴度差别不明显,无统计学意义(P0.05)。5小鼠体重变化(攻毒5天后)与Control组相比,从第二天到第六天除FI-RSV+Cp G组外其它各组均无统计学差异(P0.05),FI-RSV+Cp G组从第二天到第四天体重减轻显著低于Control组(P0.05),第五天、第六天FI-RSV+Cp G组体重下降与Control组无显著性差异(P0.05)。6细胞计数结果显示6.1巨噬细胞各免疫组巨噬细胞百分比显著低于Control组(P0.05),FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+LPS组显著高于FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组和FI-RSV组(P0.05),且FI-RSV+LPS组显著高于FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-control组(P0.05)。6.2中性粒细胞各免疫组中性粒细胞百分数显著高于Control组(P0.05),FI-RSV+LPS组显著低于除Control组外其它各组(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组中性粒细胞百分数显著高于其它各组(P0.05)。6.3淋巴细胞各免疫组淋巴细胞百分数显著高于Control组(P0.05),FI-RSV+LPS组显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+poly(I:C)组(P0.05)。6.4细胞总数各免疫组细胞总数显著高于Control组(P0.05),FI-RSV+Cp G组细胞总数显著高于其它各组(P0.05),其它各免疫组差异不显著,无统计学意义(P0.05)。7肺组织染色Control组、FI-control组、FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3 My D88-/-组7.1 PAS染色的肺组织切片显示与Control组相比,各免疫组被RSV攻击后均呈现不同程度的粘液分泌,FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组、FI-RSV+Al(OH)3组的粘液分泌量较多,FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组粘液分泌量次之,FI-control组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Pam Cys3组粘液分泌量较少,FI-RSV+LPS组看不到粘液分泌。7.2 HE染色的肺组织切片显示Control组小鼠肺泡壁结构完整,肺泡周围仅存在少量炎性细胞;FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+poly(I:C)组和FI-control组小鼠支气管周围和肺泡间质炎性细胞增多,肺泡壁轻微增厚;FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组肺泡壁增厚,肺泡间质细胞炎性细胞较多,FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组、FI-RSV+Al(OH)3组小鼠经RSV攻击后肺部气管周围浸润大量炎症细胞,肺泡壁增厚,肺泡腔减小。FI-RSV+LPS组偶见少量炎症细胞浸润肺泡间质,肺泡壁正常,支气管周围偶见少量炎症细胞。8肺匀浆滴定Control组未检测到病毒,FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Cp G组病毒滴度显著低于FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组、FI-control组(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组与FI-control组无显著性差异(P0.05)。9 ELISA检测肺冲洗上清中细胞因子显示9.1 IFN-γFI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Pam Cys3组IFN-γ含量显著高于Control组、FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+LPS组及FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组(P0.05),其余各免疫组无明显差异(P0.05)。9.2 IL-4FI-control组、FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV组IL-4含量显著高于Control组、FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组(P0.05),FI-RSV+Pam Cys3组显著高于FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Al(OH)3组(P0.05),其余各组无显著差异(P0.05)。9.3 IL-10FI-RSV组IL-10含量显著高于Control组和其它免疫组(P0.05),FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Pam Cys3组IL-10含量显著高于FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组(P0.05)。9.4 IL-13FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV组IL-13含量显著高于Control组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组(P0.05);FI-RSV+Pam Cys3组IL-13含量显著高于FI-control组、FI-RSV+poly(I:C)组(P0.05),其余各免疫组间无明显差异(P0.05)。9.5 IL-17FI-RSV组IL-17含量显著高于Control组和各免疫组(P0.05),FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组IL-17含量显著低于FI-RSV+Cp G组(p0.05),其它各组无显著性差异(P0.05)。9.6 TNF-αFI-control组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组FI-RSV+Pam Cys3组TNF-α含量显著高于FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组和Control组(P0.05),其它各组无显著性差异(P0.05)。9.7 IL-1βFI-RSV组IL-1β含量显著高于各免疫组与Control组(P0.05),FI-RSV+LPS组显著低于FI-control组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Pam Cys3组(P0.05)。9.8 IL-6FI-RSV+Pam Cys3组IL-6含量显著高于Control组和其它免疫组(P0.05),FI-RSV组IL-6含量显著高于Control组、FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组(P0.05),其余各免疫组无明显差异(P0.05)。10 RT-PCR检测细胞因子表达显示10.1 T-betFI-RSV+Cp G组T-bet表达量显著高于除FI-RSV+poly(I:C)以外其它免疫组和Control组(P0.05),FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组T-bet表达量显著低于除FI-RSV+LPS组以外各免疫组和Control组(P0.05),FI-RSV+LPS组、Control组T-bet表达量显著低于FI-control组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV组(P0.05),FI-RSV+LPS组和Control组无显著差异(P0.05)。10.2 IFN-γFI-RSV+Al(OH)3组IFN-γ表达显著高于FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组、FI-control组、FI-RSV+LPS组和Control组(P0.05),其它各组无显著性差异(P0.05)。10.3 GATA-3FI-RSV+Al(OH)3组GATA-3的表达量显著高于除FI-RSV组以外其余各免疫组和Control组(P0.05),FI-control组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组GATA-3的表达量显著低于除FI-RSV+Cp G组以外其余各免疫组和Control组(P0.05),另外,FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组GATA-3的表达量显著低于FI-RSV组(P0.05)。10.4 IL-5FI-RSV+Al(OH)3组IL-5表达量显著高于其它各组(P0.05),FI-RSV+LPS组IL-5表达量显著低于其它各组(P0.05),FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+poly(I:C)组IL-5表达量显著高于除FI-RSV+Al(OH)3组以外其它各组(P0.05),且FI-RSV+Cp G组显著高于FI-RSV+poly(I:C)组(P0.05)。10.5 IL-10FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组IL-10的表达量显著低于Control组和其它免疫组(P0.05),且FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组之间无显著性差异(P0.05),FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Pam Cys3组IL-10表达量显著低于FI-control组、FI-RSV+Cp G组、FI-RSV组(P0.05)。10.6 IL-13FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+poly(I:C)组IL-13的表达量显著高于Control组和其它各免疫组(P0.05),FI-control组、FI-RSV+LPS组IL-13的表达量显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组(P0.05)。10.7 IL-17FI-RSV+LPS组IL-17的表达量显著低于除FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组以外其它组(P0.05),FI-RSV+Pam Cys3组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组显著低于FI-control组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV组、FI-RSV+Cp G组(P0.05)。10.8 ROR-γtFI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组ROR-γt的表达量显著低于除FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组以外其它各组(P0.05),FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组之间无显著性差异(P0.05),FI-control组、FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组显著高于FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Cp G组(P0.05),FI-RSV+poly(I:C)组与FI-RSV+Cp G组之间无显著性差异(P0.05)。10.9 RSV-N各免疫组RSV-N的表达显著高于FI-RSV+Pam Cys3组和Control组(P0.05);FI-RSV+Al(OH)3My D88-/-组RSV-N的表达显著高于除FI-control组以外其它各免疫组(P0.05),FI-RSV+Cp G组、FI-RSV+poly(I:C)组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+LPS组显著低于FI-RSV组、FI-control组(P0.05)。结论:1 TLR配体作为佐剂促使RSV特异性Ig G抗体水平显著提高,但对中和抗体无影响;另外,LPS可显著提高Ig G2a水平,降低Ig G1/Ig G2a的比值。而My D88缺陷组未见特异性抗体产生。2疫苗对免疫小鼠具有保护作用,TLR配体为佐剂对疫苗的保护性无显著影响。3 TLR4配体LPS作为FI-RSV的佐剂抑制了疫苗增强性疾病的发生;My D88缺陷、TLR3配体poly(I:C)和TLR2配体Pam Cys3对疫苗增强性疾病有一定的抑制作用。
【关键词】：TLR配体 RSV病毒 FI-RSV LPS 佐剂
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-12
• 英文摘要12-21
• 英文缩写21-22
• 前言22-23
• 材料与方法23-36
• 结果36-43
• 附图43-60
• 附表60-61
• 讨论61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-66
• 综述 疫苗佐剂的研究发展66-72
• 参考文献70-72
• 致谢72-73
• 个人简历73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李娜;周伟芳;刘慧敏;李赞;仇华吉;;疫苗佐剂的研究现状和发展趋势[J];中国预防兽医学报;2013年01期

2 霍宁波;;人用免疫佐剂的前景展望[J];齐鲁药事;2010年02期

3 徐灿;李兆申;杜奕奇;屠振兴;龚燕芳;许国铭;;以白细胞介素-2为免疫佐剂的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及其免疫保护作用[J];胃肠病学;2007年05期

4 周慧,李盛贤,平文祥;佐剂的研究进展[J];生物技术;2004年04期

  本文关键词：TLR配体为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病的调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：318650