肠道病毒C组96型（EV-C96）的起源、进化及生物学特征的研究

发布时间：2017-04-21 10:17

  本文关键词：肠道病毒C组96型（EV-C96）的起源、进化及生物学特征的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：肠道病毒(EV)是小RNA病毒目小RNA病毒科中肠道病毒属的成员。目前肠道病毒属共包括了12个组,即EV-A至EV-J(无EV-I)和A～C组鼻病毒。EV是最常见的医学病毒之一,但主要以隐性感染居多,很多EV感染人后不出现临床症状或仅有轻微的症状,例如非特异性出疹和轻型上呼吸道症状。但是,部分人群感染EV后也会出现各种程度的临床疾病,如急性驰缓性麻痹(AFP)、急性出血性结膜炎(AHC)、手足口病(HFMD)、无菌性脑膜炎、心肌炎及新生儿多器官衰竭等。EV-C包含有我们常见的能引起人类疾病的肠道病毒,如引起脊髓灰质炎的脊髓灰质炎病毒(PV)、引起AHC的柯萨奇病毒A组24型变种(CV-A24v),近年来,一些新型EV-C被发现,并引起了一些疫情的暴发,引起了我们对除了PV和CV-A24v外的其他EV-C的关注。EV-C96是一种新型的EV-C,其原型株BAN00-10488株在2000年分离于孟加拉国一名AFP患者的粪便标本,后陆续在亚欧大陆其他国家的AFP患者或健康人群或环境标本中有分离到。已有的EV-C96研究结果显示其在非结构蛋白区与其它EV-C均有广泛的重组现象发生,且不同的EV-C96毒株在细胞嗜性方面有所不同。由于分离数量较少,目前尚未对其进行系统的进化分析,对其细胞嗜性特点、致病力等生物学特征也知之甚少。本研究对中国1997～2012年分离的EV-C96进行了全基因组测序,并从分子水平、细胞水平对EV-C96进行了起源、分子进化、生物学特征的研究。研究目的：通过对中国自1997年起分离的EV-C96的研究,来揭示EV-C96中国分离株的基因组特征,系统分析EV-C96的起源、进化速度等进化参数,阐明我国EV-C96的地理分布和流行规律,力求在基因水平上分析其遗传进化趋势,全面系统地掌握其进化和流行情况,并进一步探讨EV-C96的受体使用情况、温度敏感性、致病力等生物学特性及其与人类疾病的关系。其研究结果将为我国新型EV相关疾病的预防控制、预测预警提供重要的基础数据。研究方法：通过RNA提取、引物设计、RT-PCR对中国分离的EV-C96进行全基因组测序,使用生物信息学研究方法,如同源性分析、构建系统发生树等,分析其基因序列特征和进化规律,采用基于贝叶斯原理的蒙特卡罗-马尔科夫链方法,系统分析EV-C96的起源、进化速度等进化参数,运用血清中和实验、细胞受体阻遏实验、温度敏感性实验等细胞与分子生物学方法研究EV-C96的生物学特性及其与人类疾病的关系。研究结果：1.所有EV-C96中国分离株在VP1区核苷酸水平的遗传距离在0.093～0.226之间,根据EV的VP1区核苷酸差异大于15%的基因型划分标准,可将所有中国EV-C96分离株分成了A～G共7个基因型。将目前报道的世界范围内的EV-C96构建VP1区系统发生树,所有EV-C96大体可分为三个簇(cluster),定义为Cluster A、Cluster B1和Cluster B2。 Cluster A与Cluster B1间遗传距离为0.254～0.305,Cluster A与Cluster B2间遗传距离为0.235～0.297,Cluster B1与Cluster B2间遗传距离为0.210-0.265。2.运用贝叶斯MCMC方法对EV-C96核苷酸序列进行进化分析,中国EV-C96株VPl区核苷酸的平均替换率为6.78×10-3/site/year,最早共同祖先可以追溯到约1972年；世界范围内EV-C96的VP1区核苷酸的平均替换率为5.31×10-3/site/year,最早共同祖先可追溯到约1930年。对世界范围内的所有EV-C96的VP1区全长核苷酸序列构建分子钟进化树,所有EV-C96分离株可分为A、B、C、D四个不同的进化分支,所有中国分离株都位于D分支。3.新疆南疆地区总体血清EV-C96抗体阳性率为65%,阳性标本抗体几何平均滴度(GMT)在1：82。其中喀什地区抗体阳性率为70%,GMT在1：82,和田地区抗体阳性率为60%,GMT在1：196。喀什地区和和田地区的GMT有较大差异,使用Mann-Whitney检验对两地的GMT进行比较,结果显示两地区的GMT存在统计学差异,P0.001。4.3-193株和GD809株只在RD细胞上产生致细胞病变效应(CPE),在HEp-2细胞无明显CPE;CHN1045株、CHN1072株、1202F株、882F株、3-156株只在HEp-2细胞产生CPE,不在RD细胞产生明显CPE；2005-T49株、9-13株在RD和HEp-2细胞均可产生明显CPE,而2012-94H株在RD和HEp-2细胞均无明显CPE。细胞受体阻遏实验显示当HEp-2细胞被抗ICAM-1抗体阻遏后,882F株不再使HEp-2细胞产生CPE,说明882F株在进入HEp-2细胞并产生CPE,很有可能使用了ICAM-1受体。5.对中国EV-C96分离株进行了温度敏感性实验,发现其中一株新疆分离株(3-193株)为温度敏感株,其它毒株均为温度不敏感株,将敏感株和非敏感株进行氨基酸和核苷酸水平比较,在3-193株的开放读码框架(ORF)中找到13个特异的氨基酸及核苷酸变异位点,5’-UTR找到3个特殊的核苷酸变异位点。研究结论：1.中国分离的EV-C96的VPl区核苷酸进化速率较快,变异大,在中国地区存在多个基因型,但都有着共同的起源。在非结构蛋白区存在多重重组,且均在2B区、2C区的5’端、3A区最有可能与CV-A24v重组。2.EV-C96各分离株之间存在不同的细胞嗜性,其中在HEp-2细胞生长并产生CPE的毒株很有可能使用了ICAM-1受体。3.血清中和试验显示EV-C96在新疆喀什地区和和田地区血清中EV-C96抗体总体阳性率较高,存在较为广泛的流行,说明EV-C96隐性感染居多,且可能存在近期感染,应加强新疆地区肠道病毒监测。4.一株新疆EV-C96分离株(3-193株)为温度敏感株。
【关键词】：肠道病毒96型 进化 重组 细胞受体
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.2
【目录】：

• 缩略语5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 一、引言13-21
• 1.1 肠道病毒概述13-14
• 1.2 肠道病毒基因组与结构14-15
• 1.3 肠道病毒的生活周期15-16
• 1.4 肠道病毒的进化16-17
• 1.5 肠道病毒分类以及分型方法17-18
• 1.6 肠道病毒C组96型(EV-C96)的背景和研究现状18-21
• 二、材料与方法21-39
• 2.1 材料21-24
• 2.2 方法24-39
• 2.2.1 细胞的复苏24-25
• 2.2.2 细胞培养25-26
• 2.2.3 细胞冻存26
• 2.2.4 噬斑纯化EV-C9626-29
• 2.2.5 EV-C96细胞嗜性研究29
• 2.2.6 EV-C96全基因组序列测定29-33
• 2.2.7 基因组序列特征及进化关系分析33-34
• 2.2.8 EV-C96全基因组重组分析34
• 2.2.9 BEAST软件进行EV-C96分子进化起源分析34-35
• 2.2.10 病毒滴度(CCID_(50))测定35
• 2.2.11 血清EV-C96中和抗体测定35-38
• 2.2.12 9株EV-C96分离株的温度敏感实验38
• 2.2.13 抗病毒受体抗体的阻遏实验38-39
• 三、结果39-73
• 3.1 EV-C96各毒株间细胞嗜性各不相同39-42
• 3.2 9株EV-C96全基因组特征分析42-47
• 3.3 EV-C96的VP1区基因特征分析47-50
• 3.4 中国分离EV-C96均在5’-UTR区和非结构蛋白区发生重组50-63
• 3.5 EV-C96的起源进化分析63-67
• 3.6 新疆南疆地区EV-C96血清流行病学67-68
• 3.7 9株EV-C96中国分离株的温度敏感性不同68-71
• 3.8 EV-C96在RD细胞和HEp-2细胞上使用受体类型的初步研究71-73
• 四、讨论73-76
• 五、结论76-78
• 参考文献78-83
• 综述83-91
• 参考文献88-91
• 致谢91-93
• 研究生期间发表和待发表的论文93

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本文编号：320128