基于CRISPR/CAS9系统的伯氏疟原虫基因组修饰技术的研究

发布时间：2021-06-09 09:59

　　一、研究背景疟疾是一种通过蚊虫叮咬传染,将疟原虫带到血液中,短时期内引起周期性规律发作的全身发冷、发热、多汗,长期多次发作后,引起贫血和脾肿大等症状的虫媒传染病,目前仍然是全球最重要的传染病之一。根据世卫组织2018年12月公布的最新估算数据,2017年全球有2.19亿起疟疾病例,共有43.5万人因疟疾感染死亡。尤其对于5岁以下儿童,疟疾仍是他们宝贵生命的巨大威胁,平均每两分钟就有一名儿童死于疟疾。基因修饰技术在疟原虫生物学研究中具有重要作用,如疟原虫基因功能研究,特别是由于疟原虫感染的种属特异性,人类疟原虫不能感染模型动物,故在抗疟药、疟疾疫苗及抗药性的研究需要以动物疟原虫感染实验动物建立模型进行体内研究。虽然通常使用的啮齿类动物疟原虫与人类疟原虫如恶性疟原虫在生物学与药物敏感性等方面都有着高度的相似性,但两者的基因组编码的同一基因在序列上并不完全相同,且人类疟原虫表达的某些基因在啮齿类动物疟原虫基因组中并不存在,这使得以啮齿类动物疟原虫为模型进行药物、抑制剂或者疫苗研究时得出的结果并不可靠。所以利用基因组修饰技术将人类疟原虫基因转入到啮齿类动物疟原虫基因组构建动物模型对于疟原虫研究... 

【文章来源】：军事科学院北京市

【文章页数】：104 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

单交叉重组机制[52]

稳定转染（图 1.2）；其中稳定转染过程主要是利用疟原虫在正常生命周期过程中，在有药物筛选压力和给与目的质粒的情况下，有极低的几率会发生同源重组，将目的基因整合到疟原虫中，以获得稳定转染的转基因虫株[39,49-51]。但是这种传统的方法有很多缺陷，比如实验耗时长，使用的实验动物多，人力物力财力都消耗巨大，且获得成功转染的概率小，得到的重组虫株基因组序列复杂等。图 1. 1 单交叉重组机制[52]

图 1. 3 质粒 pSGRNA-Cas9T2A-T7pol 模式图粒 pDONOR（图 1.4）：在质粒 pT71.1-ccdB、质粒 PL0035、质粒 pmKate2pBART 的基础上进行改造，构建含有药物筛选标记（hDHFR-yFcu）、同因模板的质粒 pDONOR，在模板元件处我们引入了红色荧光蛋白基2，帮助 mKate2 基因在伯氏疟原虫中表达的上下游非编码区我们分别选择aa 和 Pb.DHFS-FPGS-3UTR，由 T7 驱动药物筛选基因（hDHFR-yFcu）的b.DHFR-TS 3’UTR 加强药物筛选基因的表达，该质粒可为靶向 DNA 双链同源修复提供模板和可供于阳性重组疟原虫筛选的筛选标记。


本文编号：3220371