角质形成细胞抗原提呈功能研究

发布时间：2017-04-23 17:45

  本文关键词：角质形成细胞抗原提呈功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：角质形成细胞(KCs)为皮肤表皮的主要组成细胞,是机体直接与外界环境接触,最先接触外来抗原的细胞。研究发现,KCs不仅形成机体的物理屏障,同时具有重要的免疫功能。KCs在一些疾病的状态下或者直接受到干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子的刺激后,可以表达抗原提呈相关分子如主要组织相容性复合体-II(MHC-II)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)等,同时主要组织相容性复合体-I(MHC-I)也会较刺激前增高。上述改变使得KCs具备了发挥抗原提呈功能的先决条件。以往的研究仅仅证明活化后的KCs具备了发挥抗原提呈的条件,如表达一些专职抗原提呈细胞(professional APC)所特有的分子,或者利用动物实验间接证明了KCs发挥了抗原提呈的功能,但均未能拿出有说服力的直接证据。本研究通过利用流式细胞学、免疫共沉淀、质谱鉴定、Elispot等实验直接证明了KCs在活化状态下可以作为APC发挥抗原提呈功能。目的:证明KCs在特定条件下可以发挥抗原提呈功能,鉴定KCs提呈抗原肽的序列及其MHC限制性。方法:1.刺激Ha Ca T细胞表达抗原提呈相关分子:用细胞因子IFN-γ刺激人永生化角质形成细胞系(Ha Ca T细胞)致使其活化;2.质谱鉴定抗原肽:分别利用MHC-I、MHC-II单克隆抗体对活化后Ha Ca T细胞胞浆及包膜表面的主要组织相容性复合体-肽段复合物(MHC-peptide complex)进行免疫共沉淀(Co-IP),用PH3.0的酸液对共沉淀下来的MHC-肽段复合物进行解离,后经超滤管离心将两者分离,通过银染及蛋白印迹(Western blot)来验证免疫共沉淀的特异性,质谱判定MHC上所加载的肽段及其蛋白来源;3.共孵育实验:检测Ha Ca T细胞MHC-I和MHC-II每个基因座分型,根据质谱鉴定的肽段结果预测目的MHC等位基因;流式细胞术分选7例银屑病病人外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞,将IFN-γ刺激或未刺激Ha Ca T细胞分别与分选的T细胞共孵育,酶联免疫斑点测定法(Elispot)观察T细胞活化情况;4.MHC限制性验证:测序鉴定上述共孵育实验阳性患者MHC分型,与肽段预测结果比对,验证KCs抗原提呈的MHC限制性。结果:Ha Ca T细胞受到IFN-γ刺激后膜表面出现MHC-II、ICAM-1的表达,MHC-I表达较刺激前增高,且随着IFN-γ刺激浓度及时间的增加,MHC-I、MHC-II的表达呈剂量和时间依赖性增高。在保证抗原提呈相关分子表达较高及Ha Ca T细胞状态较佳的情况下,选取了IFN-γ最佳刺激浓度及刺激时间(400U/ml,48h)。Co-IP实验及质谱分析结果显示:银染及Western blot证实MHC抗体可以特异性地沉淀出MHC蛋白。质谱成功鉴定出MHC上加载肽段及其蛋白来源,包括来自胞内的角蛋白、核糖体蛋白、组蛋白等。无刺激的或IFN-γ刺激的Ha Ca T细胞分别与7例银屑病病人的CD4+T细胞及CD8+T细胞共孵育后发现,IFN-γ刺激后的Ha Ca T细胞可以使1例银屑病病人的CD4+T细胞活化,无IFN-γ刺激组的CD4+T细胞及CD8+T细胞均未活化。结论:KCs经IFN-γ刺激后可以表达专职APC如树突状细胞(DCs)、巨噬细胞(MΦ)、B淋巴细胞(B cells)所特有的MHC-II、ICAM-1等分子,MHC-I表达也较刺激前明显增高,说明刺激后的KCs具备了发挥抗原提呈的条件。质谱鉴定结果表明IFN-γ刺激后,KCs的MHC-I、MHC-II抗原结合槽中加载了肽段。共孵育实验说明活化后表达加载肽段的MHC-II分子的KCs可以活化特异性T细胞,而未活化的KCs没有这种功能。
【关键词】：角质形成细胞 MHC-I MHC-II CD4+T细胞 CD8+T细胞 抗原提呈
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R339.11
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-24
• 1 材料24-31
• 1.1 主要实验仪器24-25
• 1.2 主要实验试剂25-27
• 1.3 主要试剂配方27-31
• 1.4 实验中所用的细胞系31
• 1.5 MHC分型检测31
• 2 方法31-41
• 2.1 Ha Ca T细胞表达抗原提呈相关分子MHC-I、MHC-II、ICAM-1 的研究.31-34
• 2.2 Ha Ca T细胞MHC分型检测34-35
• 2.3 MHC结合抗原肽的免疫共沉淀(Co-IP)实验35-39
• 2.4 MHC结合抗原肽的质谱鉴定39
• 2.5 Ha Ca T细胞活化T细胞的研究39-41
• 2.6 统计方法41
• 3 结果41-49
• 4 讨论49-53
• 小结53-54
• 参考文献54-64
• 附录64-65
• 个人简历及研究成果65-66
• 致谢66-67

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 梁丽云;肠道上皮细胞的抗原提呈[J];大同医学专科学校学报;2000年03期

2 周宝宏;冯新为;;去甲肾上腺素促进人外周血单核细胞抗原提呈功能机制[J];自然杂志;1990年11期

3 王华;粘膜抗原提呈的研究进展[J];国外医学(免疫学分册);2000年02期

4 贺学英,钱晓萍,吴励,陈慰峰;小鼠胸腺树突样细胞系与胸腺树突状细胞抗原提呈能力的比较研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2003年02期

5 陆田田;黄震;陈章权;;CD1d分子的结构与功能[J];生命的化学;2008年02期

6 赵青,苑利伟,陶莎,杨洁,罗超权;CEA-rV对巨噬细胞抗原提呈功能的影响[J];广州医学院学报;2002年01期

7 陈伟;抗原提呈脂质体在体内的分布:对提呈HSV抗原rgD的影响[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1994年06期

8 孙黎飞,曹雪涛;树突状细胞的抗原提呈及免疫机制[J];前卫医药杂志;2000年03期

9 夏汉章;张友会;;促癌剂十四酰佛波乙酸酯(PMA)对细胞免疫的影响——Ⅱ.PMA抑制脾脏粘附细胞的抗原提呈功能[J];中国免疫学杂志;1986年04期

10 孙黎飞;细胞因子对肿瘤抗原提呈微环境的优化作用[J];前卫医药杂志;2001年05期

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 郝军峰;角质形成细胞抗原提呈功能研究[D];第四军医大学;2015年

2 熊敏;足细胞在抗原提呈中的作用[D];华中科技大学;2013年

3 林若蘅;LOH12CR1互作蛋白PSME1的鉴定[D];中南大学;2012年

4 桂冠;VIP对PI3K/Akt信号通路的影响在DC细胞胃癌抗原提呈中的作用研究[D];南昌大学;2014年

5 郭靖;严重创伤对细胞免疫和树突状细胞抗原提呈功能的影响[D];南华大学;2007年

  本文关键词：角质形成细胞抗原提呈功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：322758