BST-2的糖基化修饰对其抑制细胞内部病毒的作用研究

发布时间：2017-04-24 15:18

  本文关键词：BST-2的糖基化修饰对其抑制细胞内部病毒的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人和其他哺乳动物利用宿主限制因子抵御病毒的感染,病毒必须克服这些限制才能有效地在细胞内复制,BST-2/tetherin就是一种重要的受干扰素诱导的宿主限制因子。BST-2通过将新产生的病毒颗粒滞留在细胞表面起到抑制病毒释放的作用,利用的是GPI端插入病毒衣壳,TM插入宿主的细胞膜上的物理牵拉机制。在BST-2的胞外区段有两个保守的天冬氨酸位点能被糖基化修饰,但在抗病毒过程中的作用目前仍不明确。特别是最新研究发现BST-2不仅能有效抑制细胞表面的病毒,也能有效抑制在细胞内部组装的HBV,而BST-2糖基化修饰在该过程中的作用目前还没有任何相关的研究。为了研究糖基化修饰的作用,我们构建了BST-2糖基化位点的突变体BST-2N65A,BST-2 N92A,BST-2 N65,92A,并构建了相应的稳定表达细胞系,发现稳定细胞表达的BST-2的修饰状态更接近于Hela中天然的BST-2,并且是多种糖基化修饰共存。对BST-2稳定表达细胞进行细胞组分分离发现高糖基化和低糖基化的BST-2存在于不同密度的细胞组分中,而糖基化位点突变BST-2更多地以低糖基化形式出现在高密度的组分中。免疫荧光共定位实验发现BST-2突变体与ER的共定位效率相当,而BST-2 N92A和BST-2 N65,92A与CD63的共定位效率跟BST-2 WT相比明显增加。而这种与CD63定位增强的BST-2 N65,92A能更有效地抑制内部组装的HIV-1和HBV病毒的释放。最后研究不同BST-2突变体的降解途径,发现野生型BST-2和糖基化突变体与EEA1和LAMP1的共定位效率相当,暗示糖基化修饰只影响了BST-2在CD63中定位,对BST-2的降解途径并没有影响。因此我们认为BST-2的糖基化修饰会影响其在亚细胞定位,没有糖基化修饰的BST-2会更多地存在于CD63阳性囊泡中,所以对多囊泡体中组装的HIV和HBV具有更强的抑制作用。BST-2的糖基化修饰程度受到某种调控,通过调节自身的糖基化修饰状态来平衡其在细胞膜和细胞内的分布量,从而保证BST-2既能有效阻滞细胞膜表面释放的病毒也能有效地抑制在细胞内部组装的病毒的释放。本文通过研究不同BST-2糖基化突变体的细胞内定位和抗病毒作用,发现糖基化缺失的BST-2更多聚集在CD63阳性囊泡中,揭示了BST-2糖基化修饰对BST-2亚细胞定位的影响,在CD63阳性囊泡中的聚集直接导致BST-2能更有效地抑制细胞内部组装病毒,从机制上说明了糖基化修饰对于BST-2行使功能的重要性,并启发我们更深入研究BST-2在CD63阳性囊泡中的功能。
【关键词】：BST-2 糖基化 CD63 HBV
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-21
• 1.1 研究背景10-19
• 1.1.1 HIV-1 和艾滋病10-12
• 1.1.2 宿主限制因子和HIV-1 辅助蛋白12-13
• 1.1.3 BST-2 的发现13
• 1.1.4 BST-2 的信号活性13-14
• 1.1.5 BST-2 抑制细胞膜上组装的病毒的释放14-15
• 1.1.6 BST-2 抑制细胞内组装的HBV和HIV-1 的释放15-16
• 1.1.7 HIV-1 Vpu拮抗BST-2 的机制16-18
• 1.1.8 BST-2 的结构研究进展18-19
• 1.2 研究目标19-21
• 第2章 材料和方法21-28
• 2.1 实验材料、仪器和试剂21-24
• 2.1.1 质粒和突变体的构建21
• 2.1.2 主要仪器21-22
• 2.1.3 抗体22-23
• 2.1.4 菌株和细胞系23
• 2.1.5 主要试剂23-24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 点突变24
• 2.2.2 凝胶电泳鉴定24
• 2.2.3 抗性筛选24-25
• 2.2.4 细胞培养及转染25
• 2.2.5 凝胶电泳和免疫印迹25-26
• 2.2.6 蔗糖垫超速离心法收获病毒26
• 2.2.7 稳定细胞系的建立26
• 2.2.8 细胞组分分离26-27
• 2.2.9 免疫荧光27
• 2.2.10 HBV的产生和检测27-28
• 第3章 实验结果和讨论28-39
• 3.1 BST-2 糖基化突变体的修饰状态28-29
• 3.2 BST-2 糖基化突变体的亚细胞分布29-30
• 3.3 BST-2 糖基化突变体在CD63阳性囊泡中的分布30-31
• 3.4 BST-2 糖基化突变体有效抑制MVB中组装的HIV-131-32
• 3.5 BST-2 糖基化突变体有效地抑制HBV病毒的释放32-35
• 3.6 BST-2 糖基化突变体与EEA1和LAMP1的共定位35-36
• 3.7 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-49
• 作者简介及在硕士期间所取得的科研成果49-50
• 致谢50

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本文编号：324471