应用光遗传学技术精确激活大鼠中脑导水管周灰质背侧区诱发防御行为的研究
发布时间：2021-06-29 19:12
中脑导水管周灰质（PAG）被认为是调节恐惧、焦虑等负面情绪和防御性行为的最终神经通路。其中,中脑导水管周灰质背侧区（dPAG）主要负责主动性的防御行为。然而,电刺激与化学刺激作为传统的脑刺激方式,无法做到同时在时间和空间上达到精确可控,这给dPAG相关的神经功能研究及动物行为的精确控制带来了不利影响。近年来,光遗传学展示了其在激活或者抑制可兴奋细胞方面惊人的前景：当被适当波长的光照射时,光敏感离子通道打开,造成细胞膜的去极化,产生动作电位。这种基于光遗传学的技术同时拥有优异的时间和空间可控性,并且最大程度的规避了非特异性的激活或抑制。因此,选择性的使目标区域的神经元表达光敏感蛋白,即可达到对特定区域神经元特异性的控制,这为精确研究大鼠dPAG功能及在人为诱发大鼠产生防御性行为方面提供了新的方法。本研究拟利用光遗传学技术,精确激活大鼠dPAG核团,进而考察①有效光刺激强度是否与非条件反射的防御行为强度相关；②光刺激与电刺激诱发大鼠防御性行为的差异及产生差异的原因；③光刺激与电刺激激活中脑的范围；④dPAG内谷氨酸能神经元在防御性行为中的作用。本研究内容及创新点主要为：①建立了稳定的病毒包...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩写表
行为学名词定义
第一章 绪论
1.1 研究背景
1.1.1 传统脑刺激
1.1.2 基于光遗传学的光刺激
1.2 国内外研究现状
1.3 本研究目的、内容与意义
1.4 动物实验伦理陈述
第二章 光刺激系统的建立
2.1 前言
2.2 病毒包装、纯化浓缩
2.2.1 材料与方法
2.2.2 高滴度LV的制备
2.2.3 高滴度AAV的制备
2.3 病毒立体定位微注射
2.3.1 病毒脑区微注射
2.3.2 大鼠灌流取脑
2.3.3 大鼠脑冰冻切片及脑片显微成像
2.4 光路设置
2.4.1 材料与方法
2.4.2 实验步骤及结果
2.5 麻醉状态下光刺激并记录神经元电响应
2.6 讨论
第三章 光刺激强度与大鼠防御行为强度相关
3.1 前言
3.2 实验材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 溶液配制
3.3 光纤埋植
3.4 清醒状态下光刺激诱发的神经响应和行为变化
3.5 病毒感染区域及记录电极深度的确认
3.6 讨论
第四章 光刺激与电刺激诱发的大鼠防御性行为差异
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 溶液配制
4.3 光纤、电极的埋置
4.3.1 刺激电极的制作
4.3.2 光纤/刺激电极的埋植
4.4 清醒状态下行为学的比较
4.4.1 僵直阚值刺激
4.4.2 逃跑阈值刺激
4.5 讨论
第五章 光刺激通过精确激活dPAG核团诱发防御行为
5.1 前言
5.2 实验材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 溶液配制
5.3 实验步骤及结果
5.3.1 c-Fos免疫组化
5.3.2 半定量统计中脑激活强度
5.3.3 投射至大鼠dPAG脑区的神经元逆行追踪
5.3.4 投射至大鼠SC脑区的神经元逆行追踪
5.3.5 大鼠SC脑区神经元的顺行追踪
5.4 讨论
第六章 dPAG内谷氨酸能神经元可单独编码防御性行为
6.1 前言
6.2 实验材料与方法
6.2.1 实验材料
6.2.2 溶液配制
6.3 实验步骤及结果
6.3.1 携带CaMKⅡα启动子的高滴度AAV包装
6.3.2 CaMKⅡα启动子控制下 ChR2的表达
6.3.3 选择性激活dPAG谷氨酸能神经元
6.3.4 dPAG谷氨酸能神经元投射
6.3.5 SC谷氨酸能神经元投射
6.4 讨论
第七章 总结与展望
7.1 研究工作总结
7.2 研究工作展望
参考文献
作者简历
本文编号：3257000
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩写表
行为学名词定义
第一章 绪论
1.1 研究背景
1.1.1 传统脑刺激
1.1.2 基于光遗传学的光刺激
1.2 国内外研究现状
1.3 本研究目的、内容与意义
1.4 动物实验伦理陈述
第二章 光刺激系统的建立
2.1 前言
2.2 病毒包装、纯化浓缩
2.2.1 材料与方法
2.2.2 高滴度LV的制备
2.2.3 高滴度AAV的制备
2.3 病毒立体定位微注射
2.3.1 病毒脑区微注射
2.3.2 大鼠灌流取脑
2.3.3 大鼠脑冰冻切片及脑片显微成像
2.4 光路设置
2.4.1 材料与方法
2.4.2 实验步骤及结果
2.5 麻醉状态下光刺激并记录神经元电响应
2.6 讨论
第三章 光刺激强度与大鼠防御行为强度相关
3.1 前言
3.2 实验材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 溶液配制
3.3 光纤埋植
3.4 清醒状态下光刺激诱发的神经响应和行为变化
3.5 病毒感染区域及记录电极深度的确认
3.6 讨论
第四章 光刺激与电刺激诱发的大鼠防御性行为差异
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 溶液配制
4.3 光纤、电极的埋置
4.3.1 刺激电极的制作
4.3.2 光纤/刺激电极的埋植
4.4 清醒状态下行为学的比较
4.4.1 僵直阚值刺激
4.4.2 逃跑阈值刺激
4.5 讨论
第五章 光刺激通过精确激活dPAG核团诱发防御行为
5.1 前言
5.2 实验材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 溶液配制
5.3 实验步骤及结果
5.3.1 c-Fos免疫组化
5.3.2 半定量统计中脑激活强度
5.3.3 投射至大鼠dPAG脑区的神经元逆行追踪
5.3.4 投射至大鼠SC脑区的神经元逆行追踪
5.3.5 大鼠SC脑区神经元的顺行追踪
5.4 讨论
第六章 dPAG内谷氨酸能神经元可单独编码防御性行为
6.1 前言
6.2 实验材料与方法
6.2.1 实验材料
6.2.2 溶液配制
6.3 实验步骤及结果
6.3.1 携带CaMKⅡα启动子的高滴度AAV包装
6.3.2 CaMKⅡα启动子控制下 ChR2的表达
6.3.3 选择性激活dPAG谷氨酸能神经元
6.3.4 dPAG谷氨酸能神经元投射
6.3.5 SC谷氨酸能神经元投射
6.4 讨论
第七章 总结与展望
7.1 研究工作总结
7.2 研究工作展望
参考文献
作者简历
本文编号：3257000
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/3257000.html
