FKBP12在细胞程序性坏死及其介导的全身炎症反应综合征中的调控作用研究
发布时间：2021-07-04 08:35
一.研究背景细胞程序性坏死是一种新近鉴定的细胞程序性死亡,具有明确的调控靶点、具体的调控机制和确切的生理和病理功能。细胞程序性坏死是一种可调控的细胞死亡方式,只是由于死亡细胞表现出细胞坏死的形态特征（如细胞器肿胀和细胞膜破裂等）,因而被命名为细胞程序性坏死（programmed cell death,necroptosis）。已有研究表明,死亡配体、化疗药物、病原微生物（细菌和病毒）入侵等多种因素都能诱导细胞程序性坏死,从而决定了它具有广泛的生物学功能,在胚胎发育,缺血再灌注损伤和炎症等生理和病理过程中发挥重要调控作用。因此,鉴定调控细胞程序性坏死的新靶点并探讨其调控机制,可以为细胞程序性坏死相关疾病的药物研发及临床治疗提供理论指导与参考。FK506结合蛋白 12（FK506-bindingprotein 12,FKBP12）是一种分子量为12kD的亲免素家族蛋白,含有肽基-脯氨酰异构酶结构域,可以催化多肽或蛋白质脯氨酸残基中N端肽键的顺反构象变化,改变底物蛋白的活性。同时,FKBP12也可发挥分子伴侣和接头蛋白的作用,介导蛋白复合体的组装和活化。因此,FKBP12具有多种生物学功能,...
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
透射电镜观察TNFα诱导的L929细胞程序性坏死
军事科学院博士学位论文接下来，我们使用 Annexin V-FITC 和碘化丙锭 （propidium iodide，PI）双染法（Annexin V-FITC/PI）检测 TNFα 诱导的 L929 和 HT22 细胞死亡类型。流式细胞仪检测结果显示（图 1.2 A 和 B），TNFα 与 Z-VAD 联合处理组 L929 及 HT22细胞中，大部分都是 Annexin V-FITC 和 PI 双阳性的细胞（坏死细胞的特征），而不是 Annexin-V-FITC 单阳性（早期凋亡细胞的特征），表明细胞发生的是程序性坏死，而不是凋亡。同时，我们分别使用 RIPK1，RIPK3 和 MLKL 的抑制剂 Necrostatin-1，GSK’872和 NSA 对细胞进行处理，发现 TNFα 联合 Z-VAD 诱导的 L929 和 HT22 细胞死亡可被这三种抑制剂显著抑制（图 1.2 A、B），进一步证实了 TNFα 诱导的 L929 及HT22 细胞死亡是程序性坏死。因此，我们通过 TEM 超微结构分析、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测及蛋白抑制剂处理实验，证实了在 Z-VAD 存在下，由 TNFα 诱导的 L929 和 HT22 细胞死亡是程序性坏死，可以作为细胞模型来鉴定 FKBP12 在细胞程序性坏死过程中的调控作用。
L929 细胞的存活率显著降低，而 FK506、吡美莫司（pimecrolimus）、雷（rapamycin）、依维莫司（everolimus）、佐他莫司（zotarolimus）和 ridaforol多种 FKBP12 配体都能够显著提高 L929 细胞的存活率，表明 FKBP12 配体制 TNFα 诱导的细胞程序性坏死。同时，我们对 FK506 和 Rapamycin 抑制 TNFα 诱导细胞程序性坏死的结量化分析。在细胞程序性坏死过程中，由于细胞膜的破裂，Annexin V-FIT 都能进入细胞并分别与磷脂酰丝氨酸及 DNA 结合，形成 Annexin V-FITC 和阳性细胞，因而不存在 Annexin V-FITC 单独染色的细胞，因此，可用 PI 单流式细胞仪测定来判断细胞的死亡，这一方法在前期发表的细胞程序性坏中多有应用[65-67]，也是检测细胞程序性坏死的经典方法。图 1.4 的结果506 和 Rapamycin 都能够显著降低 PI 阳性 L929 细胞的比例，表明 FK50pamycin 能够阻断 TNFα 诱导的细胞程序性坏死，进一步验证了 FKBP12 在序性坏死过程中的调控作用。以上实验结果为后续课题的进行提供了重要。
【参考文献】：
博士论文
[1]肿瘤坏死因子TNFα及冬凌草甲素诱导小鼠成纤维肉瘤L929细胞死亡的机制研究[D]. 叶元超.沈阳药科大学 2012
本文编号：3264442
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
透射电镜观察TNFα诱导的L929细胞程序性坏死
军事科学院博士学位论文接下来，我们使用 Annexin V-FITC 和碘化丙锭 （propidium iodide，PI）双染法（Annexin V-FITC/PI）检测 TNFα 诱导的 L929 和 HT22 细胞死亡类型。流式细胞仪检测结果显示（图 1.2 A 和 B），TNFα 与 Z-VAD 联合处理组 L929 及 HT22细胞中，大部分都是 Annexin V-FITC 和 PI 双阳性的细胞（坏死细胞的特征），而不是 Annexin-V-FITC 单阳性（早期凋亡细胞的特征），表明细胞发生的是程序性坏死，而不是凋亡。同时，我们分别使用 RIPK1，RIPK3 和 MLKL 的抑制剂 Necrostatin-1，GSK’872和 NSA 对细胞进行处理，发现 TNFα 联合 Z-VAD 诱导的 L929 和 HT22 细胞死亡可被这三种抑制剂显著抑制（图 1.2 A、B），进一步证实了 TNFα 诱导的 L929 及HT22 细胞死亡是程序性坏死。因此，我们通过 TEM 超微结构分析、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测及蛋白抑制剂处理实验，证实了在 Z-VAD 存在下，由 TNFα 诱导的 L929 和 HT22 细胞死亡是程序性坏死，可以作为细胞模型来鉴定 FKBP12 在细胞程序性坏死过程中的调控作用。
L929 细胞的存活率显著降低，而 FK506、吡美莫司（pimecrolimus）、雷（rapamycin）、依维莫司（everolimus）、佐他莫司（zotarolimus）和 ridaforol多种 FKBP12 配体都能够显著提高 L929 细胞的存活率，表明 FKBP12 配体制 TNFα 诱导的细胞程序性坏死。同时，我们对 FK506 和 Rapamycin 抑制 TNFα 诱导细胞程序性坏死的结量化分析。在细胞程序性坏死过程中，由于细胞膜的破裂，Annexin V-FIT 都能进入细胞并分别与磷脂酰丝氨酸及 DNA 结合，形成 Annexin V-FITC 和阳性细胞，因而不存在 Annexin V-FITC 单独染色的细胞，因此，可用 PI 单流式细胞仪测定来判断细胞的死亡，这一方法在前期发表的细胞程序性坏中多有应用[65-67]，也是检测细胞程序性坏死的经典方法。图 1.4 的结果506 和 Rapamycin 都能够显著降低 PI 阳性 L929 细胞的比例，表明 FK50pamycin 能够阻断 TNFα 诱导的细胞程序性坏死，进一步验证了 FKBP12 在序性坏死过程中的调控作用。以上实验结果为后续课题的进行提供了重要。
【参考文献】：
博士论文
[1]肿瘤坏死因子TNFα及冬凌草甲素诱导小鼠成纤维肉瘤L929细胞死亡的机制研究[D]. 叶元超.沈阳药科大学 2012
本文编号：3264442
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