抗ICOSL单链抗体的人源化改造、表达及其生物学功能鉴定

发布时间：2017-04-26 06:08

  本文关键词：抗ICOSL单链抗体的人源化改造、表达及其生物学功能鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究旨在通过将抗ICOSL单链抗体(anti-ICOSL-scFv)与IgG1 CH3连接,对anti-ICOSL-scFv进行人源化改造,以期获得对治疗器官移植引起的排异反应具有良好抑制作用的融合蛋白。本实验室之前的研究中,构建了鼠源抗ICOSL单链抗体库,并通过核糖体展示技术从中筛选出抗ICOSL的特异性单链抗体(anti-ICOSL-scFv)。但是,由于单链抗体缺少了Fc片段,在体内的半衰期短,在血液中很容易被清除。为了弥补这一缺陷,我们将anti-ICOSL-scFv与CH3基因连接,从而对单链抗体进行人源化改造。具体结果如下：1 Anti-ICOSL-scFv-CH3基因的克隆首先从人外周血单个核细胞中提取出总RNA；其次运用RT-PCR扩增出IgG1的CH3片段的基因；然后再运用SOE-PCR将CH3基因与anti-ICOSL-scFv的基因连接,获得重组基因,并通过凝胶电泳和基因测序鉴定重组基因。结果表明：重组的anti-ICOSL-scFv-CH3基因序列与我们预期的一致。2 Anti-ICOSL-svFv-CH3蛋白的表达、纯化以及活性检测将重组基因构建到pET43.1a中,转入E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达。对经过鉴定的诱导表达正确的抗体用金属螫合亲和层析(Ni-NTA)进行分离纯化,得到纯度较高的抗体蛋白。并经过间接ELISA和Western blot鉴定其特异性,结果显示：我们成功构建了anti-ICOSL-scFv-CH3/pET43.1a表达载体,并且重组抗体蛋白与其抗原ICOSL能够特异性结合。3 Anti-ICOSL-scFv-CH3的生物学功能检测为了准确地检测融合蛋白的生物学功能,我们以anti-CD28蛋白和生理盐水作为阴性对照组,anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白为实验组,进行小鼠尾部皮肤移植后,分别对不同的组注射抗体蛋白和生理盐水,并观察被移植皮肤的愈合情况。实验结果显示：相对于anti-CD28蛋白和生理盐水两个对照组,注射anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白,对小鼠皮肤移植的抗排异反应的效果比较明显,移植皮肤的伤口能够在注射抗体蛋白愈合良好,并逐渐有新鼠毛长出；而两对照组出现伤口溃烂和结痂等现象。这表明anti-ICOSL-scFv-CH3融合蛋白对皮肤移植排异反应具有明显的抑制作用。Anti-ICOSL-scFv-CH3这一功能蛋白为治疗器官移植的排异反应等方面的研究提供了基础。
【关键词】：ICOSL 单链抗体 IgG1 C_H3 人源化改造 器官移植 排异反应
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.4
【目录】：

• 英文缩略词表7-8
• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一部分 文献综述11-34
• 第一章 ICOSL分子的研究进展12-22
• 1.1 ICOSL分子及其受体ICOS分子结构12-14
• 1.2 ICOSL的分布及其表达14
• 1.3 ICOSL的作用机制及生物学功能14-16
• 1.4 ICOSL在相关疾病方面的研究16-18
• 1.4.1 ICOSL与肿瘤16
• 1.4.2 ICOSL与自身免疫性疾病16-17
• 1.4.3 ICOSL与器官移植排异反应17-18
• 参考文献18-22
• 第二章 单链抗体的研究进展22-29
• 2.1 单链抗体的结构与构建22-23
• 2.2 单链抗体的表达23-24
• 2.3 单链抗体的应用24-26
• 2.3.1 单链抗体在肿瘤诊断与治疗方面的应用24-25
• 2.3.2 单链抗体在自身免疫疾病的应用25
• 2.3.3 单链抗体在抗器官移植排异反应的应用25-26
• 2.4 单链抗体的应用前景与展望26-27
• 参考文献27-29
• 第三章 抗体人源化研究进展29-34
• 3.1 抗体人源化的策略29-31
• 3.1.1 嵌合型抗体29-30
• 3.1.2 CDR移植抗体30
• 3.1.3 噬菌体抗体库技术构建的人源化抗体30-31
• 3.2 抗体人源化的应用与前景31-33
• 参考文献33-34
• 第二部分 实验研究34-69
• 第四章 Anti-ICOSL-scFv-C_H3基因的克隆35-48
• 摘要35-36
• Abstract36-37
• 1 材料与方法37-42
• 1.1 主要试剂与材料37-38
• 1.2 实验方法38-42
• 1.2.1 C_H3基因的克隆38-40
• 1.2.1.1 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离38
• 1.2.1.2 PBMC总RNA的提取38
• 1.2.1.3 PBMC的cDNA的合成38-39
• 1.2.1.4 感受态细胞的制备39
• 1.2.1.5 C_H3基因的扩增以及鉴定39-40
• 1.2.2 Anti-ICOSL-scFv基因片段的扩增40-41
• 1.2.3 Anti-ICOSL-scFv基因片段与C_H3基因的连接41-42
• 2 结果42-45
• 2.1 C_H3基因的克隆42-43
• 2.2 Anti-ICOSL-scFv基因的扩增43-44
• 2.3 Anti-ICOSL-scFv与C_H3基因的连接44-45
• 3 讨论45-47
• 参考文献47-48
• 第五章 Anti-ICOSL-svFv-C_H3蛋白的表达、纯化以及活性检测48-61
• 摘要48-49
• Abstract49-50
• 1 材料与方法50-55
• 1.1 主要试剂与材料50
• 1.2 实验方法50-55
• 1.2.1 重组表达载体的构建50-52
• 1.2.1.1 质粒的提取50
• 1.2.1.2 酶切反应50-51
• 1.2.1.3 目的片段的磷酸化和载体的去磷酸化51
• 1.2.1.4 目的片段与载体的连接反应51-52
• 1.2.2 重组载体的转化52
• 1.2.3 菌落PCR鉴定52-53
• 1.2.4 重组anti-ICOSL-scFv-C_H3的蛋白诱导表达53
• 1.2.5 重组表达产物的纯化53-54
• 1.2.6 免疫印迹(Western blot)分析54
• 1.2.7 ELISA鉴定人源化单链抗体的亲和力54-55
• 2 结果55-58
• 2.0 重组表达载体的构建55
• 2.1 重组anti-ICOSL-scFv-C_H3的蛋白表达与纯化55-56
• 2.2 免疫印迹(Western blot)分析56-57
• 2.3 ELISA鉴定人源化单链抗体的亲和力57-58
• 3 讨论58-60
• 参考文献60-61
• 第六章 Anti-ICOSL-scFv-C_H3的生物学功能检测61-69
• 摘要61-62
• Abstract62-63
• 1 材料与方法63-64
• 1.1 主要试剂与材料63
• 1.2 实验方法63-64
• 1.2.1 实验分组63
• 1.2.2 供体小鼠皮肤的分离63-64
• 1.2.3 受体小鼠的皮肤移植64
• 2 结果64-65
• 3 讨论65-67
• 参考文献67-69
• 第三部分 全文结论69-71
• 全文结论70-71
• 攻读硕士学位期间研究成果71-72
• 致谢72

【参考文献】

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1 潘阳;王露楠;;单克隆抗体人源化技术研究进展[J];国际检验医学杂志;2011年13期

  本文关键词：抗ICOSL单链抗体的人源化改造、表达及其生物学功能鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：327871