SIRT1的选择性剪接在衰老过程中的作用研究

发布时间：2017-04-26 15:19

  本文关键词：SIRT1的选择性剪接在衰老过程中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：衰老是生物体内发生的渐进性多器官、多层次、多方面的复杂变化过程,其后果是机体功能的衰退或失调。机体衰老的基础是细胞的衰老,这一过程受遗传和环境因素的共同调节。目前,虽然有多种学说从不同方面解释衰老的发生,但其关键机制以及调控方式仍不明确。沉默信息调节因子2同源物1(Silent mating type information regulation2 homolog1,SIRT1)是一个NAD+依赖的组蛋白脱乙酰基酶,经其去乙酰化作用影响P53,P16,FOXO,NF-κB,和PGC-1α等不同的下游分子,进而对细胞的衰老、程序性死亡、新陈代谢等不同过程进行调控。研究发现SIRT1在热量限制(Caloric restriction,CR)引起的生命周期的延长中发挥了关键作用,从而引发了研究者的广泛兴趣。在体外,SIRT1能够抑制氧化应激和高糖诱导的内皮细胞以及干细胞的衰老;在啮齿类动物的相关研究也发现,SIRT1在衰老过程以及年龄依赖的器官功能下降中发挥重要作用。然而SIRT1对部分下游分子,甚至生理或病理进程的作用研究常常存在相互矛盾的报道。这提示SIRT1的功能可能存在更加复杂的机制和调控因素。SIRT1的序列高度保守,且长期被认为不存在剪接变异体。但2010年Lynch等的研究显示人类及小鼠的SIRT1 pre-m RNA存在选择性剪接,即产生缺失第八外显子的SIRT1(SIRT1-ΔExon8)和SIRT1全长(SIRT1-FL)两种变异体。新近研究发现,SIRT1-ΔExon8的生物学作用及调控机制与SIRT1-FL存在较大差异。在前期的实验过程中,我们发现大鼠体内可能也存在SIRT1的选择性剪接,由于大鼠与人和小鼠的SIRT1结构不同,后者具有9个外显子,而大鼠具有8个外显子,因此其产生的选择性变异体也不同。实验显示,大鼠可能产生与小鼠或人SIRT1-ΔExon8的生物学作用与调控机制相似的缺失第七外显子的SIRT1(SIRT1-ΔExon7)。已知SIRT1在衰老进程中发挥着重要作用,但其剪接变异体是否影响衰老进程目前尚无报道。本研究在前期实验的基础上,利用衰老的细胞模型和动物实验证实大鼠的选择性剪接,以及观察大鼠SIRT1的选择性剪接在衰老过程可能发挥的作用。第一部分SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖诱导的293T细胞衰老模型中的作用观察目的:通过观察缺失第八外显子的SIRT1选择性剪接变异体(SIRT1-ΔExon8)在D-半乳糖(D-gal)诱导的293T细胞衰老模型中的表达变化,初步探讨SIRT1-ΔExon8对细胞衰老进程的影响。方法:1.CCK8法测定不同浓度D-半乳糖(0,5,10,15,20 g/L)对293T细胞活力的影响。2.选取终浓度为10 g/L的D-半乳糖DMEM高糖培养基作用于第3代293T细胞,继续培养至第6代,建立细胞衰老模型,应用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色方法观察衰老细胞的阳性率。3.RT-PCR检测诱导组与对照组细胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 m RNA的表达水平。结果:1.CCK-8结果显示10 g/L的D-半乳糖培养基能诱导细胞衰老且不引起细胞过度损伤。2.诱导组衰老细胞阳性率74.25±3.62%高于对照组7.68±1.43%(P0.05)。3.RT-PCR结果显示诱导组SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8 m RNA表达水平分别较对照组降低了78.26±5.16%和88.03±3.27%(P0.05)。小结:1.SA-β-gal染色结果提示D-半乳糖诱导的293T细胞衰老模型建立成功。2.衰老细胞组的SIRT1-FL以及SIRT1-ΔExon8 m RNA表达水平较对照组均显著降低,提示SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8可能参与调控细胞衰老进程。第二部分SIRT1-ΔExon7在大鼠衰老过程中的表达改变及意义目的:证实大鼠海马组织中存在SIRT1的选择性剪接变异体;观察SIRT1全长及缺失第七外显子的SIRT1选择性剪接变异体(SIRT1-ΔExon7)在不同年龄段大鼠海马组织中表达变化,从而初步探讨SIRT1全长及SIRT1-ΔExon7在衰老进程中的表达改变。方法:1.通过PCR产物的凝胶电泳及c DNA测序检测扩增目的基因是否为SIRT1-ΔExon7。2.将不同日龄(P7,P90,P720)大鼠海马组织进行冰冻切片,并应用SA-β-gal染色并观察细胞衰老阳性率。3.RT-PCR测定不同年龄段大鼠海马组织中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 m RNA的表达水平。结果:1.琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示,大鼠海马组织存在SIRT1-ΔExon7的表达。2.SA-β-gal染色结果显示新生鼠偶见SA-β-gal阳性衰老细胞,而老年大鼠可见大量胞浆呈淡蓝色的SA-β-gal阳性衰老细胞,提示随年龄增加大鼠脑内细胞的SA-β-gal活性逐渐增强,衰老细胞呈年龄依赖性递增趋势。3.RT-PCR结果显示P90组及P720组SIRT1-FL m RNA表达水平与P7组相比均无明显差异;而SIRT1-ΔExon7 m RNA表达水平分别升高了77.40±7.38%和89.28±9.23%(P0.05)。小结:1.大鼠体内存在缺失第7外显子的SIRT1选择性剪接变异体。2.SIRT1-ΔExon7在衰老海马组织中呈现高表达。第三部分SIRT1-ΔExon7在诱导大鼠MSCs衰老细胞中的表达变化及意义目的:为了更进一步研究SIRT1以及SIRT-Δ7在衰老过程的作用,我们采用诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)衰老细胞模型,观察SIRT-Δ7在细胞衰老过程中的表达变化。方法:1.将MSCs细胞反复传代至第18代,β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察衰老细胞阳性率。2.RT-PCR检测衰老组与对照组细胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 m RNA的表达水平。结果:1.随着细胞不断传代SA-β-gal阳性衰老细胞增加,衰老组细胞阳性率57.64%±7.39%明显高于对照组16.35%±2.17%(P0.05)。2.RT-PCR结果显示衰老组SIRT1-FL m RNA表达水平较对照组降低了20.09±2.74%(P0.05);和SIRT1-ΔExon7m RNA表达水平较对照组升高了132.85±11.07%(P0.05)。小结:衰老细胞中SIRT1-ΔExon7表达显著升高,提示SIRT1-ΔExon7可能在衰老过程发挥作用。结论:1.首次证实大鼠存在SIRT1的选择性剪接,形成选择性变异体SIRT1-ΔExon7,而不是之前报道的SIRT1-ΔExon8。2.整体动物及离体实验(两种来源的细胞)均观察到衰老过程中SIRT1-ΔExon7表达水平的改变,提示SIRT1的选择性剪接可能在衰老进程发挥作用。
【关键词】：衰老 SIRT1 选择性剪接 SIRT1-ΔExon8 SIRT1-ΔExon7 大鼠
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R339.38
【目录】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 常用缩写词中英文对照表14-15
• 前言15-17
• 第一部分 SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖诱导的293T细胞衰老模型中的作用观察17-27
• 1 材料与方法17-23
• 1.1 材料和试剂17-19
• 1.2 实验方法19-22
• 1.3 图像分析和统计学处理22-23
• 2 结果23-25
• 2.1 CCK-8 法检测细胞活力23
• 2.2 衰老相关的SA-β-gal染色23-24
• 2.3 RT-PCR检测SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 的mRNA含量24-25
• 3 讨论25-27
• 第二部分 SIRT1-ΔExon7 在大鼠衰老过程中的表达改变及意义27-35
• 1 材料与方法27-30
• 1.1 材料和试剂27-29
• 1.2 实验方法29
• 1.3 图像分析和统计学处理29-30
• 2 结果30-33
• 2.1 大鼠缺失第七外显子SIRT1 mRNA的鉴定30-31
• 2.2 衰老相关SA-β-gal染色31
• 2.3 缺失第7外显子的SIRT1 在衰老组的表达发生改变31-33
• 3 讨论33-35
• 第三部分 SIRT1-ΔExon7 在诱导大鼠MSCs衰老细胞中的表达变化及意义35-43
• 1 材料与方法35-39
• 1.1 材料和试剂35-37
• 1.2.实验方法37
• 1.3 图像分析和统计学处理37-39
• 2 结果39-41
• 2.1 衰老相关SA-β-gal染色39
• 2.2 SYBR Green Real-time PCR39-41
• 3 讨论41-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 综述48-53
• 参考文献51-53
• 致谢53-54
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果54-55
• 个人简历55

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本文编号：328719