一种具有双嗜性功能融合蛋白FN/CDH的制备及其促粘附、成骨生物活性鉴定
发布时间：2021-07-30 10:26
目的构建一种具有同嗜性和异嗜性细胞粘附功能的重组融合蛋白FN/CDH,验证其对人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell,hMSCs）的促粘附、成骨效能。方法以纤维连接蛋白（fibronectin,FN）和钙粘附蛋白11（CDH11）作为前体分子,通过生物信息学分析了解其结构序列与功能基团。采用"同源模建"作为分子模拟策略确定FN和CDH11功能片段的接合方式。常规PCR扩增FNⅢ7-10和CDH11 EC1-2基因片段后应用重叠延伸PCR（splice-overextension PCR,SOE-PCR）进行基因拼接。将融合基因插入原核表达载体pET-22b构建重组载体,重组载体转化表达菌株Rsoetta-gami（DE3）,实现rFN/CDH的诱导表达,蛋白纯化。免疫印迹确定融合蛋白种属,离心促粘附实验和成骨诱导验证rFN/CDH体外生物活性。结果成功构建了pET22b-FNⅢ7-10/CDH11 EC1-2融合基因原核表达载体,获得了rFN/CDH的可溶性表达,纯化后rFN/CDH的纯度达到96%。初步验证了各个融合蛋白表达属性的准确性,证实rFN...
【文章来源】：第三军医大学学报. 2013,35(23)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
rFN/CDH融合蛋白的免疫印迹分析
，此浓度下rFN/CDH对MC3T3-E1的吸附作用较单独FN或CDH作用高出40%和192%(P＜0．05);rFN/CDH具有良好的促进成骨细胞粘附的生物活性。见图4、5。40003500300025002000150010005000510152025303540蛋白浓度（μg/mL）aa粘附效能（/wel）CDH11EC1蛳2FNⅢ7蛳10rFN/CDHa:P＜0．05，与CDH11EC1-2和FNⅢ7-10比较图4rFN/CDH促进MC3T3-E1粘附效能-浓度曲线ABCDA:Hoechst标记的MC3T3-E1在PBS空白对照;B:CDH阳性对照(5μg/mL);C:FN阳性对照(5μg/mL);D:rFN/CDH实验组(5μg/mL)图5倒置荧光显微镜下观察rFN/CDH的促粘附活性(×200)2．4rFN/CDH融合蛋白的促成骨作用2．4．1rFN/CDH融合蛋白影响hMSCs成骨诱导后ALT酶活力ALP酶活力在hMSCs诱导10d后即有变化。在rFN/CDH(5μg/mL)处理的TCPS表面，ALP酶活力最高为14．46±0．46，分别较CDH阳性对照组(9．09±0．12)和FN阳性对照组(10．64±0．37)增加59%和34%(P＜0．05)。提示rFN/CDH较CDH和FN具有更好的促进早期发生成骨分化的作用。2．4．2rFN/CDH融合蛋白影响hMSCs成骨诱导后OCN基因表达在rFN/CDH(5μg/mL)处理的TCPS表面，OCNmＲNA表达水平是CDH和FN阳性对照组的1．69倍和2．27倍(P＜0．05)。提示rFN/CDH可更好地促进和启动hMSCs成骨相关基因OCN的表达上调，rFN/CDH具有良好的促进细胞成骨分化的生物活性，用rFN/CDH涂层的TCPS表面对干细胞朝成骨方向分化具有显著影响。3讨论骨种子细胞在支架材料界面的高效粘附和靶向分化是骨修复性能的关键，但目前采用的多种界面改造手段由于所选择的靶分子作用单一、活性有限，修饰方2539第35卷第23期2013年12月15日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol．35，No．23Dec．152013
【参考文献】：
期刊论文
[1]成骨细胞特异性钙黏蛋白涂布脱钙骨基质材料对BMSCs黏附及成骨分化能力的影响[J]. 向强,邓聪颖,张远,张超,周跃. 中国修复重建外科杂志. 2009(05)
[2]Cad-Ⅱ基因转染的hMSCs在异种骨基质材料上的粘附和增殖研究[J]. 向强,邓聪颖,陈庆海,郭国宁,张远,郑文杰,周跃. 第三军医大学学报. 2009(05)
[3]Cad-Ⅱ基因转染的兔骨髓间充质干细胞自体移植术后的表达研究[J]. 向强,邓聪颖,郑文杰,郭国宁,张远,张超,周跃. 中国矫形外科杂志. 2009(01)
本文编号：3311235
【文章来源】：第三军医大学学报. 2013,35(23)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
rFN/CDH融合蛋白的免疫印迹分析
，此浓度下rFN/CDH对MC3T3-E1的吸附作用较单独FN或CDH作用高出40%和192%(P＜0．05);rFN/CDH具有良好的促进成骨细胞粘附的生物活性。见图4、5。40003500300025002000150010005000510152025303540蛋白浓度（μg/mL）aa粘附效能（/wel）CDH11EC1蛳2FNⅢ7蛳10rFN/CDHa:P＜0．05，与CDH11EC1-2和FNⅢ7-10比较图4rFN/CDH促进MC3T3-E1粘附效能-浓度曲线ABCDA:Hoechst标记的MC3T3-E1在PBS空白对照;B:CDH阳性对照(5μg/mL);C:FN阳性对照(5μg/mL);D:rFN/CDH实验组(5μg/mL)图5倒置荧光显微镜下观察rFN/CDH的促粘附活性(×200)2．4rFN/CDH融合蛋白的促成骨作用2．4．1rFN/CDH融合蛋白影响hMSCs成骨诱导后ALT酶活力ALP酶活力在hMSCs诱导10d后即有变化。在rFN/CDH(5μg/mL)处理的TCPS表面，ALP酶活力最高为14．46±0．46，分别较CDH阳性对照组(9．09±0．12)和FN阳性对照组(10．64±0．37)增加59%和34%(P＜0．05)。提示rFN/CDH较CDH和FN具有更好的促进早期发生成骨分化的作用。2．4．2rFN/CDH融合蛋白影响hMSCs成骨诱导后OCN基因表达在rFN/CDH(5μg/mL)处理的TCPS表面，OCNmＲNA表达水平是CDH和FN阳性对照组的1．69倍和2．27倍(P＜0．05)。提示rFN/CDH可更好地促进和启动hMSCs成骨相关基因OCN的表达上调，rFN/CDH具有良好的促进细胞成骨分化的生物活性，用rFN/CDH涂层的TCPS表面对干细胞朝成骨方向分化具有显著影响。3讨论骨种子细胞在支架材料界面的高效粘附和靶向分化是骨修复性能的关键，但目前采用的多种界面改造手段由于所选择的靶分子作用单一、活性有限，修饰方2539第35卷第23期2013年12月15日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol．35，No．23Dec．152013
【参考文献】：
期刊论文
[1]成骨细胞特异性钙黏蛋白涂布脱钙骨基质材料对BMSCs黏附及成骨分化能力的影响[J]. 向强,邓聪颖,张远,张超,周跃. 中国修复重建外科杂志. 2009(05)
[2]Cad-Ⅱ基因转染的hMSCs在异种骨基质材料上的粘附和增殖研究[J]. 向强,邓聪颖,陈庆海,郭国宁,张远,郑文杰,周跃. 第三军医大学学报. 2009(05)
[3]Cad-Ⅱ基因转染的兔骨髓间充质干细胞自体移植术后的表达研究[J]. 向强,邓聪颖,郑文杰,郭国宁,张远,张超,周跃. 中国矫形外科杂志. 2009(01)
本文编号：3311235
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