突变Y141D恢复唾液酸转移酶活性的研究及其活性中心氢键链的作用分析

发布时间：2017-04-27 22:03

  本文关键词：突变Y141D恢复唾液酸转移酶活性的研究及其活性中心氢键链的作用分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：唾液酸是九碳链带有负电荷的α酮酸唾液酸,唾液酸参与多种生理和病理过程,例如细胞间通讯、信号转导、细菌和病毒感染以及癌症转移等。唾液酸转移酶催化了唾液酸从胞嘧啶核苷酸(CMP-Sia)转向受体,是生理和病理中重要唾液酸及其相关分子的合成中的关键酶。由细菌中得到的唾液酸转移酶由于其灵活的底物特异性以及在大肠杆菌中的高效的表达被广泛用于合成各种各样的包含唾液酸的结构。唾液酸转移酶GT80(Pm0106)在保守的DDG模体中141位包含一个自然突变DY,这个突变同样存在GT52和所有GT80家族中,而且证明是没有活性的。除此之外,一条位于Pm0106活性中心的氢键链(Asp141-Asn109-Asp33)的结构被证明在四中GT80唾液酸家族都是保守的。为探究141位突变以及氢键链对Pm0106酶活性的作用,分别设计了Pm0106突变株Y141D、M144D141D、D141N、D141N-N109D、D141N-N109D-D33N、N109A141D、D33A141D以及D33L141D。以pET-15b为载体,NdeI和Xho I为酶切位点,通过双酶切建立重组质粒。通过突变PCR得到各个突变株,转化E.Coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达产生分别产生各个突变株蛋白,用SDS-PAGE分析,检测蛋白浓度。建立高效液相色谱法检测各个突变株酶反应活性,质谱检测反应产物,通过建立不同PH反应体系,HPLC分析各个产物峰,得到最适合反应的pH。用薄层层析技术检测Y141D,N109A141D以及D33A141D经过45℃、50℃处理30min后酶反应活性,比较各个突变株的稳定性以及不同构象的底物对反应的影响。分析Pm0106酶活反应分别得出Y141D 1/80,M144D141D1/80,N109A141D1/80时反应产物与剩余底物之间的比例较合适,D141N,D33A141D,D33L141D以一倍浓度时反应较合适,而D141N-N109D,D141N-N109D-D33N反应活性较低几乎检测不到反应。通过HPLC检测,计算产物峰与原料峰的比例,在缓冲液为pH达8.0时反应程度达到最大值,由此推测此反应缓冲液的最适pH为8.0。通过薄层层析可知无论是以aLac还是β-Lac为受体,野生型Pm0160都没有活性,而突变株Y141D,M144D141D,N109A141D,D33A141D,D33L141D以及对照PmST1都有较好的反应活性,突变株D141N,D141N-N109D,D141N-N109D-D33N没有反应活性。在经过45℃处理30min后Y141D,N109A141D以及D33A141D的活性都减小,而50℃处理30min后Y141D保留很小的活性,N109A141D和D33A141D的活性丧失。本研究表明Pm0106唾液酸转移酶反应的最适pH为8.0其DDG模体中141位天冬氨酸作为广义碱,是维持唾液酸转移酶活性必须的,由141位天冬氨酸以及邻近的109位天冬酰胺形成的氢键对于维持蛋白结构稳定性有不可缺少的作用,而33位天冬氨酸和39位丙氨酸之间位于的螺旋在调节酶活性方面也起了一定作用。
【关键词】：唾液酸转移酶 Pm0106 氢键链 广义碱 高效液相色谱法
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1.前言12-32
• 1.1 唾液酸及其研究意义12-14
• 1.1.1 唾液酸的生理功能12-14
• 1.1.1.1 唾液酸的抗肿瘤作用12-13
• 1.1.1.2 唾液酸抗老年性痴呆的作用13
• 1.1.1.3 唾液酸的抗病毒作用13-14
• 1.2 糖基转移酶14-18
• 1.2.1 糖基转移酶的分类14-16
• 1.2.2 多糖和糖基转移酶的功能16-18
• 1.2.2.1 植物中的分布及作用16
• 1.2.2.2 细菌中的分布及作用16-17
• 1.2.2.3 哺乳动物中的分布及作用17-18
• 1.3 唾液酸转移酶及其分类18-22
• 1.3.1 唾液酸转移酶18
• 1.3.2 唾液酸转移酶的分类18-21
• 1.3.2.1 PmsT20-21
• 1.3.2.2 Pm010621
• 1.3.3 唾液酸转移酶的催化反应机理21-22
• 1.4 模体及其分类22-23
• 1.4.1 模体22
• 1.4.2 常见模体的分类：22-23
• 1.5 广义碱23-24
• 1.5.1 酸碱的定义23-24
• 1.6 氢键链24-26
• 1.6.0 氢键24
• 1.6.1 氢键的形成条件24
• 1.6.2 氢键的饱和性和方向性24-25
• 1.6.3 氢键的存在对物质的某些性质的影响25-26
• 1.6.4 氢键链及其作用26
• 1.7 高效液相色谱法及其的检测原理26
• 1.8 飞行时间质谱( MALDI-TOF)的原理及操作流程26-28
• 1.8.1 MALDI-TOF-MS的基本原理26-27
• 1.8.2 MALDI-TOF-MS的关键因素及解离模式27
• 1.8.3 MALDI-TOF-MS中样品的测量方法及点靶方法27
• 1.8.4 MALDI-TOF-MS的操作过程及其注意事项27-28
• 1.9 国内外研究现状28-30
• 1.10研究目的和意义30-32
• 2 材料与方法32-52
• 2.1 材料32-38
• 2.1.1 Pm0106基因32
• 2.1.2 载体来源32
• 2.1.3 感受态细胞32
• 2.1.4 主要实验试剂及耗材32-34
• 2.1.4.1 主要试剂32-33
• 2.1.4.2 实验仪器33-34
• 2.1.5 主要试剂的配制34-38
• 2.1.5.1 培养基的配制34-35
• 2.1.5.2 DNA琼脂糖凝胶电泳相关溶液的配制35
• 2.1.5.3 蛋白电泳相关溶液的配制35-36
• 2.1.5.4 蛋白的表达纯化相关溶液的配制36-37
• 2.1.5.5 酶促反应缓冲液及溶液的配制37
• 2.1.5.6 薄层色谱展开剂的配制37-38
• 2.1.5.7 薄层色谱显色剂的配制38
• 2.1.5.8 高效液相色谱流动相的配制38
• 2.2 实验方法38-52
• 2.2.1 重组质粒的构建38-41
• 2.2.1.1 野生型 Pm0106 表达系统的构建38
• 2.2.1.2 引物的序列及合成38
• 2.2.1.3 载体的选择38-39
• 2.2.1.4 PCR 体系（50μL）如下39-40
• 2.2.1.5 PCR 的程序40
• 2.2.1.6 0.8%琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物40
• 2.2.1.7 酶切40-41
• 2.2.1.8 回收产物连接41
• 2.2.1.9 连接反应产物转化41
• 2.2.1.10 重组质粒的测序检测41
• 2.2.2 取测序正确的质粒转化：41-43
• 2.2.3 Pm0106突变株Y141D、M144D141D、D141N、D141N-N109D、D141N-N109D-D33N、N109A141D、D33A141D、D33L141D蛋白的表达与纯化43-48
• 2.2.4 建立酶反应体系48-52
• 3 结果分析52-62
• 3.1 以pET15b为载体的目的基因的克隆及其突变的构建结果52-53
• 3.1.1 目的基因的PCR扩增结果52
• 3.1.2 Pm0106突变株的突变结果52-53
• 3.2 蛋白的表达与纯化及浓度测定结果53-55
• 3.2.1 Pm0106各个突变株的蛋白表达53
• 3.2.2 蛋白浓度的测定53-55
• 3.3 酶活性反应结果55-62
• 3.3.1 高效液相色谱检测各个突变株反应结果55-58
• 3.3.2 飞行时间质谱检测突变株Y141D酶活反应产物及原料结果58
• 3.3.3 HPLC检测不同PH对酶活反应影响的结果58-60
• 3.3.4 HPLC检测 45℃处理不同时间后Y141D（A），N109A141D(B)，D33L141D的反应结果60
• 3.3.5 薄层层析技术检测个突变株酶活性的结果60-62
• 4.讨论62-65
• 4.1 高效液相色谱法检测唾液酸转移酶Pm0106各个突变株参与反应活性的必要性62
• 4.2 唾液酸转移酶Pm0106各个突变株参与反应的必须条件及合适的酶浓度62-63
• 4.3 Y141D突变株酶活反应在不同PH下的影响63-64
• 4.4 底物和温度对突变株反应的影响64-65
• 5.结论65-66
• 参考文献66-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表论文情况72

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