鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSIT p 7诱导RAW264.7细胞自噬及相关信号通路研究

发布时间：2021-08-01 22:35

　　目的:鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）是一种可引起人和禽类呼吸道感染的专性胞内寄生菌。质粒蛋白是衣原体重要的毒力因子,目前对其确切的致病机制研究较局限。本研究旨在探究Cps质粒蛋白诱导RAW264.7细胞自噬及相关信号通路,为进一步阐明Cps感染致病机制提供重要的实验依据。方法:将本课题组前期已经构建好的pET28a-CPSIT_p7重组菌接种至固体培养基中,选取阳性菌落扩大培养,经Ni²⁺NTA亲和层析柱纯化蛋白,超滤管浓缩后获得CPSIT_p7蛋白。经亲和层析去除内毒素后,分别用浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的CPSIT_p7蛋白刺激RAW264.7细胞18 h,以DPBS作为阴性对照,间接免疫荧光检测LC3荧光斑点,Western blot技术检测LC3、Beclin1、SQSTM1/p62的蛋白表达水平。用CPSIT_p7（10μg/mL）刺激RAW264.7细胞30 min、60 min、90 min、120 m... 

【文章来源】：南华大学湖南省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

CPSIT_p7重组蛋白诱导表达SDS-PAGE图

图 4.2 重组蛋白 CPSIT_p7 纯化 SDS-PAGE 图4. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CPSIT_p7 purification. M:Marker, 1: theflow liquid; 2-5:10 mM, 20 mM, 40 mM and 100 mM imidazole concentration washing li:150 mM imidazole concentration washing liquid; 8-9: 250mM imidazole concentration e CPSIT_p7 刺激 RAW264.7 细胞后的细胞毒性将RAW264.7细胞铺板于96孔板内，按照LDH试剂盒说明书检测CPSI RAW264.7 细胞后的细胞毒性，得到如图 4.3 的结果。LDH 检测试剂 LDH 是一种稳定的蛋白质，在胞浆内含量丰富，正常情况下不能通过当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 活性亡数目成正比，通过检测细胞培养上清液中 LDH 的活性，判断细胞的。图 4.3 显示，CPSIT_p7 各浓度刺激组相比与对照组 LDH 活性无明显差

图 4.3 在刺激 18h 后，监测 LDH 释放（450 nm 处吸光度） After 18 hours post-stimulation, LDH release was monitored (absorbaT_p7 诱导 RAW264.7 细胞自噬免疫荧光法检测 CPSIT_p7 刺激细胞后 LC3 的表 CPSIT_p7 刺激后是否会诱导 RAW264.7 细胞发生自噬，测 LC3 的荧光斑点。用倒置荧光显微镜观察结果，发，经 CPSIT_p7 刺激的实验组 LC3 荧光斑点明显增加（CPSIT_p7 能诱导 RAW264.7 细胞自噬。

【参考文献】：
期刊论文
[1]沙眼衣原体pORF5质粒蛋白诱发小鼠生殖道免疫损伤初步研究[J]. 邓红玉,李忠玉,吴移谋,周辉,马康康,陆春雪,钟光明.  中华微生物学和免疫学杂志. 2013 (02)



本文编号：3316365