miRNA-30a/30e腺病毒表达载体的构建

发布时间：2021-08-01 23:36

　　目的构建稳定表达成熟miRNA-30a和miRNA-30e腺病毒表达载体。方法小鼠基因组中分别扩增出带有酶切位点的mmu-miR-30a、mmu-miR-30e目的基因,目的基因连接到穿梭质粒pSES-HUS,带有目的基因的穿梭质粒重组到骨架质粒AdEasy1上,重组质粒转染到Hek-293细胞中包装成腺病毒载体,反复扩增之后获得高滴度的pAd-mmu-miR-30a、pAd-mmu-miR-30e腺病毒。用目的腺病毒分3组（RFP对照组,miR-30a组,miR-30e组）感染小鼠Mefs细胞,用荧光定量PCR方法检测mmu-miR-30a、mmu-miR-30e表达情况。结果分别扩增出带有酶切位点的357 bp mmu-miR-30a,324 bp mmu-miR-30e,并成功连接到pSES-HUS上,进一步与AdEasy1重组,包装得到腺病毒表达载体,通过荧光定量PCR检测,Mefs细胞中mmu-miR-30a升高26.46±7.46倍,mmu-miR-30e升高2.76±0.25倍。结论成功构建了成熟miRNA的腺病毒表达载体。 

【文章来源】：南方医科大学学报. 2013,33(02)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 实验材料
    1.2 实验方法
        1.2.1 小鼠基因组DNA的提取
        1.2.2 引物设计
        1.2.3 目的片段的获得
        1.2.4 目的片段亚克隆到穿梭质粒p SES-HUS
        1.2.5 亚克隆产物的扩增、筛选及鉴定
        1.2.6 重组质粒的获得及Hek-293细胞内包装成腺病毒
        1.2.7 高滴度腺病毒表达载体的获得
        1.2.8 荧光定量PCR鉴定mi RNA-30a和mi RNA-30e的表达情况
    1.3 统计学方法
2 结果
    2.1 目的片段的分离扩增
    2.2 克隆产物的获得及筛选鉴定
    2.3 重组质粒的鉴定
    2.4 Hek-293细胞中包装腺病毒结果
    2.5 实时荧光定量PCR鉴定p Ad-mi R-30a和p Ad-mi R-30e的表达情况
3 讨论



本文编号：3316451