表达Ag85基因重组卡介苗的构建

发布时间：2021-08-02 17:04

　　为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1 447、1 402、1 453和1 330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85... 

【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(02)北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

线性化载体及目的基因PCR扩增结果

分别以重组质粒pMV261-Ag85A、pMV261-Ag85B、pMV261-Ag85C、pMV261-Ag85D为模板,利用引物对pMV261-1进行PCR鉴定,结果显示,在1 400 bp左右均出现特异性条带(图2),与预期结果一致。分别使用限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ对4个重组质粒进行双酶切鉴定。质粒pMV261-Ag85B、pMV261-Ag85C、pMV261-Ag85D酶切后得到两条大小不同的片段,分别为载体片段4 334 bp和Ag85(B、C、D)片段大小1 002、1 053和930 bp,pMV261-Ag85A质粒酶切后得到3条大小不同的片段,分别为4 334、682和365 bp(图3),均与预期结果一致。将鉴定正确的重组载体进行序列测定,测序结果与Tuberculist中公布的Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因序列进行比对,核苷酸及氨基酸序列相似性均为99%。表明4个重组质粒构建成功。图3 重组质粒BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定结果

重组质粒BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定结果

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3317944