中药肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内铜转运通路的分子调控机制研究

发布时间：2017-04-29 08:10

  本文关键词：中药肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内铜转运通路的分子调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson’s disease,WD),是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。WD患者因位于13q14.3的ATP7b基因发生突变,出现铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)合成障碍及铜在胆汁中的排泄障碍,并导致过量的铜在肝脏、脑、肾脏、角膜等组织脏器中沉积,患者可出现肝硬化、神经/精神症状、角膜K-F环等临床表现,严重者可危及生命。WD是少数可以治疗的神经遗传病之一,但以金属络合剂为主的治疗方法因毒副反应使许多患者不能耐受,严重影响本病患者的病情和预后。上世纪70年代以来,本课题单位以中药肝豆汤治疗WD患者获得良好疗效。虽然我们发现肝豆汤有显著的细胞内排铜作用,但其产生疗效的确切机制尚不明确。本课题在前期研究基础上进一步探讨肝豆汤对WD模型-TX小鼠肝细胞内铜转运通路相关蛋白的调控作用,在分子水平初步阐明肝豆汤改善WD患者临床症状的疗效机理。目的:研究肝豆汤调控TX小鼠肝细胞内铜转运通路的分子靶点并观察其相应的调控机制。方法:采用原子吸收法检测含肝豆汤兔血清作用不同浓度、不同时间点,对TX小鼠肝细胞内铜含量的影响;原子吸收法检测不同浓度含肝豆汤兔血清作用24h后,对TX小鼠肝细胞内微量元素的影响;FITC染色经流式细胞仪检测经含肝豆汤兔血清孵育后TX小鼠肝细胞内ATP7b,CTR1,ATOX1,CCS,MT,COX17相关蛋白的表达;Western blotting法检测经含肝豆汤兔血清作用后ATP7b,CTR1,ATOX1,CCS,MT,COX17相关蛋白的表达;免疫荧光双标记经激光共聚焦显微镜观察由含肝豆汤兔血清孵育后TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白的亚细胞定位变化。结果:1.含肝豆汤兔血清对TX小鼠肝细胞内铜代谢的调控(1)原子吸收法实验结果表明含肝豆汤兔血清在一定时间和浓度范围内可显著降低TX小鼠肝细胞内铜含量,且呈一定的时效和量效关系。(2)与DL组相比,含肝豆汤兔血清作用24 h后可显著降低TX小鼠肝细胞内铜含量,增加锌含量,降低铁含量(P0.01)。(3)Western blot法和FITC染色流式细胞仪检测结果显示,经含肝豆汤兔血清作用后可显著(P0.01)增加ATP7b蛋白表达。(4)Western blot法和FITC染色流式细胞仪检测结果显示,含肝豆汤兔血清剂量依赖性激活铜代谢相关蛋白ATOX1、CCS、COX17的表达(P0.01)。(5)Western blot法和FITC染色流式细胞仪检测显示含肝豆汤兔血清显著降低CTR1、MT蛋白表达(P0.01)。2.含肝豆汤兔血清对TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白亚细胞定位和功能表达的影响(1)免疫荧光结果显示,ATP7b蛋白在DL小鼠肝细胞内定位于TGN,位于高铜环境中则转运至顶端膜区,去除高铜环境则重新定位于TGN。(2)ATP7b蛋白在TX小鼠肝细胞内不能定位于TGN及顶端膜区域,去除高铜环境也不能促使ATP7b蛋白重新定位于TGN。中药肝豆汤可促使ATP7b蛋白逐步重新定位于TGN。结论:肝豆汤可能是通过调控细胞内铜代谢相关蛋白,上调ATP7b、ATOX1、CCS、COX17蛋白表达,抑制CTR1、MT表达,从而发挥细胞内排铜作用。肝豆汤可以通过诱导ATP7b蛋白重新定位于TGN,进而发挥细胞内排铜作用,改善WD的临床症状。肝豆汤可通过多靶点、多途径调控铜代谢通路达到降低肝细胞内铜含量的治疗效果。
【关键词】：Wilson病 肝豆汤 TX小鼠 ATP7b蛋白 铜代谢通路 亚细胞定位
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5;R-332
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 英文缩略词13-15
• 前言15-19
• 第一部分 中药肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内铜代谢的分子调控机制研究19-55
• 1 实验材料和仪器19-23
• 1.1 细胞19
• 1.2 药物19-20
• 1.3 主要试剂20-21
• 1.4 主要试剂配制21-23
• 1.5 主要仪器23
• 2 实验方法23-33
• 2.1 中药肝豆汤的制备23-24
• 2.2 含药血清制备及保存24
• 2.3 TX小鼠基因检测24-25
• 2.4 细胞培养25-26
• 2.5 细胞计数26-27
• 2.6 含药血清处理浓度、时间筛选27
• 2.7 实验分组及药物处理27
• 2.8 肝细胞内微量元素含量测定27-28
• 2.9 流式细胞仪检测肝细胞内铜代谢相关蛋白的表达28
• 2.10 Western blot法检测肝细胞内铜代谢相关蛋白的表达28
• 2.11 蛋白样品制备28-29
• 2.12 蛋白含量的测定29-30
• 2.13 SDS－PAGE凝胶电泳30-32
• 2.14 统计学方法32-33
• 3 实验结果33-49
• 3.1 含药血清处理浓度、时间筛选(原子分光光度法)33-34
• 3.2 不同剂量含肝豆汤兔血清对DL、TX小鼠肝细胞内微量元素含量的影响34-37
• 3.2.1 不同剂量含肝豆汤兔血清对DL、TX小鼠肝细胞内铜含量的影响34-35
• 3.2.2 不同剂量含肝豆汤兔血清对DL、TX小鼠肝细胞内锌含量的影响35-36
• 3.2.3 不同剂量含肝豆汤兔血清对DL、TX小鼠肝细胞内铁含量的影响36-37
• 3.3 流式细胞仪检测肝细胞内铜代谢相关蛋白的表达37-43
• 3.3.1 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内Ctr1蛋白表达的影响37-38
• 3.3.2 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内ATOX1蛋白表达的影响38-39
• 3.3.3 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白表达的影响39-40
• 3.3.4 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内COX17蛋白表达的影响40-41
• 3.3.5 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内CCS蛋白表达的影响41-42
• 3.3.6 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内MT蛋白表达的影响42-43
• 3.4 Western blot法检测肝细胞内铜代谢相关蛋白的表达43-49
• 3.4.1 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内Ctr1蛋白表达的影响43-44
• 3.4.2 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内ATOX1蛋白表达的影响44-45
• 3.4.3 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白表达的影响45-46
• 3.4.4 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内COX17蛋白表达的影响46-47
• 3.4.5 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内CCS蛋白表达的影响47-48
• 3.4.6 肝豆汤对TX小鼠肝细胞内MT蛋白表达的影响48-49
• 4 讨论49-54
• 4.1 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内微量元素的影响49-51
• 4.2 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内铜代谢相关蛋白的影响51-54
• 4.2.1 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内Ctr1蛋白表达的影响51
• 4.2.2 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内ATOX1蛋白表达的影响51-52
• 4.2.3 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白表达的影响52
• 4.2.4 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内COX17蛋白表达的影响52-53
• 4.2.5 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内CCS蛋白表达的影响53-54
• 4.2.6 中药肝豆汤对TX小鼠肝细胞内MT蛋白表达的影响54
• 5 小结54-55
• 第二部分 中药肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白亚细胞定位和功能表达的影响55-65
• 1 实验材料和仪器55-57
• 1.1 细胞55
• 1.2 药物55
• 1.3 主要试剂55-56
• 1.4 主要试剂配制56
• 1.5 主要仪器56-57
• 2 实验方法57-58
• 2.1 细胞分离、培养和细胞计数57
• 2.2 实验分组及含药血清处理57-58
• 2.3 ATP7b蛋白亚细胞定位检测58
• 2.4 统计学方法58
• 3 结果58-63
• 3.1 高铜对DL小鼠肝细胞内ATP7b蛋白亚细胞定位的影响58-60
• 3.2 不同剂量含肝豆汤兔血清对TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白亚细胞定位的影响60-63
• 4 讨论63-64
• 5 小结64-65
• 总结65-67
• 参考文献67-74
• 综述74-86
• 参考文献80-86
• 附录86-87
• 致谢87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 叶群荣;胡纪源;王共强;韩咏竹;饶娆;赵静;马心锋;张杰;;Wilson病临床症状特征和中医证型分析[J];安徽中医学院学报;2013年04期

2 王峤;丁圆;王静敏;黄琼辉;赵程峰;刘玉鹏;李溪远;吴桐菲;宋金青;王玉洁;杨艳玲;;3例Menkes病患儿的临床与ATP7A基因分析及1例产前诊断研究[J];中国当代儿科杂志;2014年06期

  本文关键词：中药肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内铜转运通路的分子调控机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：334498