RTA与LANA共调控let-7a/RBPJ信号在KSHV复制中的作用
发布时间：2021-08-20 07:31
背景:卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）又称为人疱疹病毒8型,是卡波氏肉瘤（KS）的病原。KSHV感染后在体内有潜伏感染（latent）和裂解激活（lytic）两种状态。潜伏相关核抗原（LANA）是维持KSHV潜伏感染的关键因子,在KSHV感染的细胞中持续表达。复制与转录激活因子（RTA）是KSHV裂解复制的“开关”分子,仅在病毒初始感染（de novo infection）和裂解复制时表达。重组信号序列结合蛋白J kappa（RBPJ）在KSHV复制调控方面呈现双重效应,与LANA或RTA结合分别发挥维持潜伏感染和促进裂解复制的功能,但RBPJ维持潜伏感染和促进裂解复制功能相互转变的机制尚不完全清楚。RTA和LANA启动子上均有RBPJ结合元件,而我们前期研究发现LANA通过let-7a/RBPJ信号调控KSHV潜伏感染;RTA下调Let-7a,上调RBPJ。提示let-7a/RBPJ信号受RTA和LANA的双重调控,并因此影响RTA和LANA自身的表达来控制KSHV潜伏和裂解复制的转变。目的:明确RTA、LANA对let-7a/RBPJ信号共调控作用,RBPJ在RTA和LANA相互...
【文章来源】：杭州师范大学浙江省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RTA可能通过NF-κB/Lin28B信号调节let-7a水平(A、B)在293t细胞中转染RTA表达载体以空载体作为对照，培养48h后收集细胞，分别提取总蛋白和总RNA
图 3 KSHV 从初始感染到潜伏建立过程中 let-7a、RBPJ 的表达水平（A-F）用 500ng/ml 多西环素（DOX）持续诱导 iSLK-219 细胞 3 天中间不换液，获取的病毒子感染 HMEC-1 细胞 0，2，4，8，16，24 ，72h 后收获细胞。(A)倒置荧光显微镜查看绿荧光的强度。（B、C、D、F）采用 qPCR 技术分别检测 LANA、RTA、let-7a、RBPJ 的表达情况。（E）Western Blot 检测 RBPJ 的蛋白表达水平。结果表示为：平均值±SEM。T 检验确定 P 值。*Р<0.05， **Р<0.01，NS：没有显着差异。4.3 KSHV 裂解复制时 let-7a、RBPJ 的表达水平由以上结果可知：当其从初始感染到潜伏建立过程中，RTA 的表达逐渐降低甚至消失，而 LANA 的表达量逐渐增加后趋于稳定。而 RBPJ、let-7a 的表达水平则随着 RTA，LANA 的变化而变化。Lan ke 实验室证明在 KSHV 激活过程中 RTA 的表达水平呈现时序性变化。因而引起 RTA 与 LANA 比值的时序性波动
杭州师范大学学术论文 结果胞比例逐渐上升。采用 qPCR 技术检测 RTA 和 LANA 的表达水平，结果显示 RTA表达水平快速显著增加，LANA 的表达水平也随着诱导时间的延长有所增加（图4A,B）。随后我们又做了 RTA 和 LANA 的绝对定量（图 3C,D,E）进一步确定 RTA和 LANA 的比值在 KSHV 激活过程中的动态变化，图 C 为 RTA 和 LANA 标准曲线。由图 D,E 可知：在 0h 即潜伏感染时 LANA 的表达量大约是 RTA 的 20 倍而在 DOX 诱导 12h 时 RTA 却是 LANA 的 18 倍左右，72h 时最大约 30 倍，因此RTA 与 LANA 的比值是随着 DOX 诱导时间的增加而增加的。qPCR 技术检测了let-7a 的表达水平，提示随着诱导时间的延长 let-7a 表达量逐渐降低（图 F），采用 qPCR 及蛋白印迹技术检测了 RBPJ 的转录及蛋白水平，结果显示随着 DOX诱导时间的延长 RBPJ 表达量逐渐增加（图 G,H），由以上结果可知：KSHV 激活过程中，RBPJ 随着 RTA/LANA 比值的时序性增加而增加，let-7a 却相反。
【参考文献】：
硕士论文
[1]LANA通过let-7a/RBPJ信号通路抑制KSHV的裂解复制[D]. 齐燕.杭州师范大学 2018
本文编号：3353085
【文章来源】：杭州师范大学浙江省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RTA可能通过NF-κB/Lin28B信号调节let-7a水平(A、B)在293t细胞中转染RTA表达载体以空载体作为对照，培养48h后收集细胞，分别提取总蛋白和总RNA
图 3 KSHV 从初始感染到潜伏建立过程中 let-7a、RBPJ 的表达水平（A-F）用 500ng/ml 多西环素（DOX）持续诱导 iSLK-219 细胞 3 天中间不换液，获取的病毒子感染 HMEC-1 细胞 0，2，4，8，16，24 ，72h 后收获细胞。(A)倒置荧光显微镜查看绿荧光的强度。（B、C、D、F）采用 qPCR 技术分别检测 LANA、RTA、let-7a、RBPJ 的表达情况。（E）Western Blot 检测 RBPJ 的蛋白表达水平。结果表示为：平均值±SEM。T 检验确定 P 值。*Р<0.05， **Р<0.01，NS：没有显着差异。4.3 KSHV 裂解复制时 let-7a、RBPJ 的表达水平由以上结果可知：当其从初始感染到潜伏建立过程中，RTA 的表达逐渐降低甚至消失，而 LANA 的表达量逐渐增加后趋于稳定。而 RBPJ、let-7a 的表达水平则随着 RTA，LANA 的变化而变化。Lan ke 实验室证明在 KSHV 激活过程中 RTA 的表达水平呈现时序性变化。因而引起 RTA 与 LANA 比值的时序性波动
杭州师范大学学术论文 结果胞比例逐渐上升。采用 qPCR 技术检测 RTA 和 LANA 的表达水平，结果显示 RTA表达水平快速显著增加，LANA 的表达水平也随着诱导时间的延长有所增加（图4A,B）。随后我们又做了 RTA 和 LANA 的绝对定量（图 3C,D,E）进一步确定 RTA和 LANA 的比值在 KSHV 激活过程中的动态变化，图 C 为 RTA 和 LANA 标准曲线。由图 D,E 可知：在 0h 即潜伏感染时 LANA 的表达量大约是 RTA 的 20 倍而在 DOX 诱导 12h 时 RTA 却是 LANA 的 18 倍左右，72h 时最大约 30 倍，因此RTA 与 LANA 的比值是随着 DOX 诱导时间的增加而增加的。qPCR 技术检测了let-7a 的表达水平，提示随着诱导时间的延长 let-7a 表达量逐渐降低（图 F），采用 qPCR 及蛋白印迹技术检测了 RBPJ 的转录及蛋白水平，结果显示随着 DOX诱导时间的延长 RBPJ 表达量逐渐增加（图 G,H），由以上结果可知：KSHV 激活过程中，RBPJ 随着 RTA/LANA 比值的时序性增加而增加，let-7a 却相反。
【参考文献】：
硕士论文
[1]LANA通过let-7a/RBPJ信号通路抑制KSHV的裂解复制[D]. 齐燕.杭州师范大学 2018
本文编号：3353085
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