甲肝病毒3C蛋白酶识别序列有效性的研究

发布时间：2017-04-30 01:13

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【摘要】：甲型肝炎病毒简称甲肝病毒（HAV）是1973年由Feinslone首先发现的一种以肝脏损害为主的肠道小RNA病毒。HAV3C蛋白酶是HAV唯一的自身蛋白水解酶，分子量约为20kD，是具有S（丝氨酸）/C（半胱氨酸）性质的蛋白酶，其活性中心是Cys-His-Tyr。虽然不直接参与病毒RNA的复制，但是它对前体多聚蛋白的正确水解有力的保证了衣壳的形成和病毒的复制。作为蛋白水解酶，3C蛋白酶就有高度的特异性，在病毒的生命周期中起着非常重要的作用，抑制其切割活性可阻断病毒复制，因此3C蛋白酶也是甲肝病毒药物治疗研究的靶点之一。 目前鉴定P3C酶切识别序列的方法为体外翻译前体多聚蛋白(兔网织红细胞裂解液)与P3C原核表达细胞裂解液30oC孵育7h。经免疫沉淀反应及SDS-PAGE确定切割条带，经蛋白N端测序确定其P3C酶切识别序列。此方法较为复杂且只能鉴定酶切位点而不能确定其P3C识别序列。 本实验利用文献报道的ProIL1B-Gluc蛋白酶检测系统，经基因合成，分子克隆成功构建了含有甲肝病毒3C蛋白酶（P3C）六个不同长度酶切识别序列（P2B-P2C）的融合蛋白报告基因。通过与P3C共转染293T细胞测定荧光值的变化及相应的Western blot可以快速精确地鉴定其P3C酶切识别序列。本实验通过此方法鉴定其P2B-P2C最短酶切识别序列为LRTQSF。 同时检测了ProIL1B-Gluc的荧光值与P3C转染质粒浓度的关系及最佳的检测时间。实验结果表明ProIL1B-Gluc荧光值随着P3C转染质粒浓度的增加而升高，最佳检测时间应在转染12h左右。这说明ProIL1B-Gluc对于HAV3C蛋白酶是一个较好的报告基因。 在体外我们验证了随着ProIL1B-Gluc与P3C孵育时间的延长，荧光值得到了明显的上升，并有明显的Western blot切割片段。证明了P3C在体外仍然具有识别序列的功能。我们的结果有助于将ProIL1B-Gluc报告基因向其它小RNA病毒3C蛋白酶进行延伸以检测与鉴定相应的酶切识别序列，也希望借助于此荧光素酶报告基因对3C蛋白酶在分子水平可以进行更深入的研究。
【关键词】：甲肝病毒 3C蛋白酶 Gaussia 荧光素酶 酶切位点 白细胞介素
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 甲型肝炎病毒11-14
• 1.1.1 甲型病毒肝炎11
• 1.1.2 甲肝病毒特征11
• 1.1.3 甲肝病毒的致病性11-12
• 1.1.4 甲肝病毒的基因型12
• 1.1.5 甲肝病毒的流行情况12-13
• 1.1.6 甲肝病毒基因组结构13
• 1.1.7 甲肝病毒的预防13-14
• 1.2 甲肝病毒 3C 蛋白酶14-15
• 1.2.1 3C 蛋白酶的结构14
• 1.2.2 3C 蛋白酶的功能14
• 1.2.3 3C 蛋白酶酶切位点14-15
• 1.2.4 蛋白酶酶切位点的检测方法15
• 1.3 Pro-Interleukin-1B-Gaussia luciferase（ProIL1B-Gluc）15-18
• 1.3.1 Gaussia 荧光素酶简介15-16
• 1.3.2 Gaussia 荧光素酶的应用16
• 1.3.3 ProIL1B-Gluc 融合蛋白荧光素酶报告基因的应用16-18
• 1.4 本课题研究目的与立题依据18
• 1.4.1 研究目的18
• 1.4.2 立题依据18
• 1.5 实验设计18-20
• 1.5.1 质粒的构建18-19
• 1.5.2 融合蛋白表达的鉴定19
• 1.5.3 ProIL1B-Gluc 转染 293T 细胞荧光值的检测19
• 1.5.4 3C 蛋白酶体外切割 ProIL1B-Gluc 报告基因19
• 1.5.5 实验设计图19-20
• 第二章 材料与方法20-32
• 2.1 实验器材20-23
• 2.1.1 实验仪器20-21
• 2.1.2 实验材料21-22
• 2.1.3 常用试剂配制22-23
• 2.2 实验方法23-32
• 2.2.1 质粒构建 PCR 及引物设计23-28
• 2.2.2 质粒构建筛选与扩增28-30
• 2.2.3 质粒转染细胞及融合蛋白表达的鉴定30-31
• 2.2.4 报告基因荧光值的检测31-32
• 第三章 实验结果32-47
• 3.1 质粒的构建32-37
• 3.1.1 Pro（9）IL1B-Gluc 质粒的构建32-33
• 3.1.2 Pro（8-5A）IL1B-Gluc 质粒的构建33-35
• 3.1.3 IL1B-Gluc 质粒的构建35-36
• 3.1.4 P3C 质粒的构建36-37
• 3.2 荧光值的检测和融合蛋白表达的鉴定与分析37-45
• 3.2.1 ProIL1B-Gluc 报告基因可行性检测37-38
• 3.2.2 P9-P5A 单转染 293T 细胞荧光值随时间的变化及其相应的 Western blot38-40
• 3.2.3 P9-P5A 单转染 293T 细胞荧光值随质粒浓度的变化及相应的 Western blot40-41
• 3.2.4 P9-P5A 六个不同酶切位点长度报告基因的可行性41-42
• 3.2.5 ProIL1B-Gluc 荧光值与 P3C 转染质粒浓度的关系42-44
• 3.2.6 ProIL1B-Gluc 与 P3C 共转染 293T 细胞荧光值随时间的变化44-45
• 3.3 ProIL1B-Gluc 与 P3C 体外切割实验45-47
• 讨论47-50
• 结论50-51
• 文献51-54
• 作者简介54-55
• 致谢55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王宏;谢广成;段招军;;小RNA病毒3C蛋白酶研究进展[J];病毒学报;2014年05期

2 刘艳;李冰清;孟红;;小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J];生物技术通报;2014年08期

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本文编号：335975