VSV G跨膜区在融合过程中的作用机制研究及亚硒酸钠通过p70S6K/p53/ULKl通路诱导ROS上调抑制保护性自噬
发布时间：2021-08-28 05:29
第一部分膜融合是一种重要的生命现象,参与多种细胞活动,包括细胞融合,囊泡转运,细胞器的动态变化以及病毒感染。几乎所有这些活动都是由一类特殊的膜蛋白——膜融合蛋白（也称为融合原）所介导的。广为熟知的融合蛋白是介导囊泡融合的SNARE复合物,在过去二十年中其作用机制已经得到深入揭示。另一种重要的融合事件是包膜病毒的融合,这是由病毒融合蛋白所介导的。病毒融合蛋白定位在病毒的包膜上,控制病毒感染的关键步骤——病毒包膜与宿主细胞膜的融合。不同的融合蛋白诱导膜融合的物理过程基本相同,但具体机制却大不相同。与SNARE复合物不同,病毒融合蛋白的构象复杂得多,这也决定了其融合机制更为复杂。在本研究中,我们关注水泡型口炎病毒的融合蛋白G蛋白的跨膜区在融合中的作用机制。我们构建了一套新的细胞-细胞融合系统,方便我们对VSVG介导的融合时间进行实时监控以及定量分析。根据这套实验系统,我们发现VSVG能够在1-2min的时间内迅速介导细胞融合。为了研究跨膜区的功能,我们将VSVG的跨膜区替换成了其他融合蛋白的跨膜区。结果显示跨膜区的替换会显著降低VSV G的融合效率及其介导的慢病毒感染效率。由于VSV G的胞...
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：116 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２三种类型的病毒融合蛋白［１３】
白的Ｈｅｌａ细胞系。将这两群细胞共培养约１２ｈ，利用ｐＨ?６．０的ＭＥＳ缓冲液诱导ｌｍｉｎ，??即可观察到细胞－细胞融合的现象一一胞浆为红色同时含有多个蓝色胞核的融合细??胞（图３），多个胞核的巨大合胞体的出现也提示多轮融合事件的发生。而不表达??ＶＳＶＧ的细胞在酸性条件下并不会发生融合（图３）。??０?Ｌ??ＶＳＶＧ?ｘ’??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?ＣＦＰ－ｎｌｓ??ＤＨ?Ｈｉ?Ｂｎ??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?ＣＦＰ－ｎｌｓ?ｎｏ?ｆｕｓｉｏｎ??■＋ＨＢ，個??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?＋?ＶＳＶ?Ｇ?ＣＦＰ－ｎｌｓ?ｆｕｓｉｏｎ??图３ＶＳＶＧ诱导的细胞－细胞融合。（Ａ）细胞－细胞融合实验原理图。胞浆表达红色荧光蛋白同??时携带有ＶＳＶＧ的细胞与胞核表达青色荧光蛋白的细胞在低ｐＨ的刺激下发生融合，融合细胞??含有红色的胞浆和多个青色的胞核。（Ｂ）?ＶＳＶＧ介导的Ｈｅｌａ细胞融合。细胞表面没有ＶＳＶＧ??低ｐＨ无法刺激融合事件的发生（上图），而ＶＳＶ?Ｇ表达细胞在酸性条件下则可以诱导大量融??合时间的发生（下图）。??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ．?（Ａ）?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｓｈｏｗｓ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ??ｆｕｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ：?ｃｅｌｌｓ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ａｎｄ?ｃｙｔｏｓｏｌ?ｌｏｃａｌｉｚｅｄ?ｄｓＲｅｄ?ｆｕｓｅ
ｐａｎｅｌ）．??同时，我们利用这一系统对ＶＳＶ?Ｇ介导的融合过程进行了实时监控。我们发??现低ｐＨ刺激ｌ－２ｍｉｎ内即可观察到红色的胞浆向临近细胞的扩散（图４），即发生了??细胞融合。这一时间动态与最近报道的ＶＳＶ病毒－脂双层半融合发生所需的２５－３０ｓ??的时间基本一致［３９］。而由于胞浆扩散过程导致时间上的延迟，因此实际的融合过??程应该发生得更为迅速，可能在数秒时间内即可完成。??ｍｍｍ??Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）?－３０?０?３０??＿鑫＿??６０?１２０?２４０??图４?ＶＳＶ?Ｇ蛋白介导细胞－细胞融合的时间轴记录。ＶＳＶ?Ｇ介导的细胞融合在酸性条件刺激后??ｌ－２ｍｉｎ内迅速发生。??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｔｈｅ?ｔｉｍｅ?ｃｏｕｒｓｅ?ｏｆ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ．?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｉｎｄｕｃｅｄ??ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ｏｃｃｕｒｒｅｄ?ｑｕｉｃｋｌｙ?ａｆｔｅｒ?ａｃｉｄｉｃ?ｂｕｆｆｅｒ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．??我们构建细胞－细胞融合模型对ＶＳＶ?Ｇ介导的融合事件进行定量分析，并通过??实时监控融合过程，对融合事件的动力学特征进行了阐释，我们发现ＶＳＶＧ介导??的膜融合过程快速且高效。??２．跨膜区的替换不会影响ＶＳＶＧ的表达及其在质膜的定位??多项研究表明，融合蛋白的跨膜区在融合过程中可作为力学元件会对脂膜产生??力的作用来促进膜融合。之前的一项研宄指出ＶＳＶ?Ｇ的跨膜区不会影响其融合功??能Ｐ８］，而这与ＳＮＡＲＥ复合物和另外一些病毒融合蛋白的相关研究结果相悖［３４－３７］。??因此
【参考文献】：
期刊论文
[1]亚硒酸钠诱导肝癌细胞凋亡机制的研究进展[J]. 舒适,黄强. 现代医学与健康研究电子杂志. 2020(02)
本文编号：3367894
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：116 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２三种类型的病毒融合蛋白［１３】
白的Ｈｅｌａ细胞系。将这两群细胞共培养约１２ｈ，利用ｐＨ?６．０的ＭＥＳ缓冲液诱导ｌｍｉｎ，??即可观察到细胞－细胞融合的现象一一胞浆为红色同时含有多个蓝色胞核的融合细??胞（图３），多个胞核的巨大合胞体的出现也提示多轮融合事件的发生。而不表达??ＶＳＶＧ的细胞在酸性条件下并不会发生融合（图３）。??０?Ｌ??ＶＳＶＧ?ｘ’??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?ＣＦＰ－ｎｌｓ??ＤＨ?Ｈｉ?Ｂｎ??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?ＣＦＰ－ｎｌｓ?ｎｏ?ｆｕｓｉｏｎ??■＋ＨＢ，個??ｄｓＲｅｄ－ｎｅｓ?＋?ＶＳＶ?Ｇ?ＣＦＰ－ｎｌｓ?ｆｕｓｉｏｎ??图３ＶＳＶＧ诱导的细胞－细胞融合。（Ａ）细胞－细胞融合实验原理图。胞浆表达红色荧光蛋白同??时携带有ＶＳＶＧ的细胞与胞核表达青色荧光蛋白的细胞在低ｐＨ的刺激下发生融合，融合细胞??含有红色的胞浆和多个青色的胞核。（Ｂ）?ＶＳＶＧ介导的Ｈｅｌａ细胞融合。细胞表面没有ＶＳＶＧ??低ｐＨ无法刺激融合事件的发生（上图），而ＶＳＶ?Ｇ表达细胞在酸性条件下则可以诱导大量融??合时间的发生（下图）。??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ．?（Ａ）?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｓｈｏｗｓ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ??ｆｕｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ：?ｃｅｌｌｓ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ａｎｄ?ｃｙｔｏｓｏｌ?ｌｏｃａｌｉｚｅｄ?ｄｓＲｅｄ?ｆｕｓｅ
ｐａｎｅｌ）．??同时，我们利用这一系统对ＶＳＶ?Ｇ介导的融合过程进行了实时监控。我们发??现低ｐＨ刺激ｌ－２ｍｉｎ内即可观察到红色的胞浆向临近细胞的扩散（图４），即发生了??细胞融合。这一时间动态与最近报道的ＶＳＶ病毒－脂双层半融合发生所需的２５－３０ｓ??的时间基本一致［３９］。而由于胞浆扩散过程导致时间上的延迟，因此实际的融合过??程应该发生得更为迅速，可能在数秒时间内即可完成。??ｍｍｍ??Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）?－３０?０?３０??＿鑫＿??６０?１２０?２４０??图４?ＶＳＶ?Ｇ蛋白介导细胞－细胞融合的时间轴记录。ＶＳＶ?Ｇ介导的细胞融合在酸性条件刺激后??ｌ－２ｍｉｎ内迅速发生。??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｔｈｅ?ｔｉｍｅ?ｃｏｕｒｓｅ?ｏｆ?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ．?ＶＳＶ?Ｇ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｉｎｄｕｃｅｄ??ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ?ｆｕｓｉｏｎ?ｏｃｃｕｒｒｅｄ?ｑｕｉｃｋｌｙ?ａｆｔｅｒ?ａｃｉｄｉｃ?ｂｕｆｆｅｒ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．??我们构建细胞－细胞融合模型对ＶＳＶ?Ｇ介导的融合事件进行定量分析，并通过??实时监控融合过程，对融合事件的动力学特征进行了阐释，我们发现ＶＳＶＧ介导??的膜融合过程快速且高效。??２．跨膜区的替换不会影响ＶＳＶＧ的表达及其在质膜的定位??多项研究表明，融合蛋白的跨膜区在融合过程中可作为力学元件会对脂膜产生??力的作用来促进膜融合。之前的一项研宄指出ＶＳＶ?Ｇ的跨膜区不会影响其融合功??能Ｐ８］，而这与ＳＮＡＲＥ复合物和另外一些病毒融合蛋白的相关研究结果相悖［３４－３７］。??因此
【参考文献】：
期刊论文
[1]亚硒酸钠诱导肝癌细胞凋亡机制的研究进展[J]. 舒适,黄强. 现代医学与健康研究电子杂志. 2020(02)
本文编号：3367894
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