广西巴马长寿地区不同年龄人群肠道菌群分析

发布时间：2017-05-02 11:11

  本文关键词：广西巴马长寿地区不同年龄人群肠道菌群分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人体肠道的微生态平衡是由肠道中巨大的微生物库与人体之间构成的,使得人体处在一个动态平衡之中,从而保证机体正常的生理活动。若这种平衡被破坏,菌群出现失调,将会引发大量相关疾病。研究表明,在宿主与肠道微生物共同进化的过程中,宿主内在因素或外在环境因素共同影响着肠道菌群的定植能力及其组成的多样性,从而影响肠道菌群的平衡。目前,肠道菌群与宿主年龄之间的关系尚不明确,但宿主的年龄又是影响长寿家族肠道菌群结构组成的一个主要因素。因此本研究征集了世界长寿乡广西巴马镇不同年龄的健康人群共计28名志愿者,并应用微生物纯培养法、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)与实时荧光定量(Real time PCR, RT-PCR)相结合的方法来研究年龄因素对广西巴马志愿者肠道菌群结构的影响,为研究人类年龄与肠道菌群的相关性提供理论依据。主要研究结果如下：1.从世界长寿乡广西巴马镇所辖3个村采集长寿家族人群的粪便样品28份,利用选择性培养基研究了粪便样品中分离的乳酸菌数量,并通过体外实验研究其耐酸耐胆盐及抑菌能力；根据年龄将样品分为4组,青少年组、中年组、老年组和长寿组。结果表明,从28份样品中共分离出1273株菌株,通过生理生化试验将1178株菌初步鉴定为乳酸菌;其中,青少年组粪便样品中乳酸菌数量最多,为9.16±0.18 lgcfu/g,随着年龄的增长,乳酸菌数量逐渐减少,中年组和老年组分别为8.93±0.35 lgcfu/g和8.67±0.351gcfu/g,但是长寿组乳酸菌数量还是保持着一个较高的水平,为8.89±0.48 lgcfu/g;中年组与老年组粪便样品中分离的乳酸菌在pH为3的人工胃液中的存活率相当,分别为40.85±3.27%和37.26±2.32%,显著高于青少年组和长寿组(P0.05),其中长寿组肠道乳酸菌耐受胃液能力最差,为28.26±3.85%；不同年龄组的乳酸菌在含0.5%耐胆盐和pH为6.8的人工肠液中的存活率无显著性差异；青少年组和中年组分离的乳酸菌抑制大肠杆菌的能力显著高于老年组和长寿组(P0.05),抑菌圈直径分别为18.67±0.98mm和17.98±0.71mm,而长寿组分离的乳酸菌抑制金黄色葡萄球菌能力略低于青少年组和中年组,但显著高于老年组,抑菌圈直径为15.41±1.48mm。2.应用PCR-DGGE技术研究了巴马长寿村不同年龄人群肠道菌群的差异。结果表明,青少年组、老年组和长寿组各组间肠道中的优势菌群亲缘性较低,主要差异性菌株是：普通拟杆菌、瘤胃球菌、青春双歧杆菌、产黑色普雷沃菌、梭菌、不可培养细菌、鲍氏不动杆菌、酸微菌属、表皮葡萄球菌、干酪乳杆菌、挑剔真杆菌和福氏埃希杆菌,但是各年龄组内的肠道中的优势菌群亲缘性较高；青少年组和长寿组组间肠道中的拟杆菌亲缘性较高,中年组和老年组组间亲缘性较高,青少年组和长寿组与中年组和老年组之间亲缘性较低,主要差异性菌株是：普通拟杆菌、类杆菌属、不可培养菌、多形拟杆菌、吉氏拟杆菌、福赛斯坦纳菌和脆弱拟杆菌,青少年组、中年组和长寿组组内肠道中的拟杆菌亲缘性较高；青少年组和长寿组组间肠道中的柔嫩梭菌亲缘性较高,与中年组和老年组亲缘性低,且中年组和老年组组间亲缘性较低,主要差异菌株是：瘤胃菌属、热纤梭菌、解纤维素梭菌、梭状芽胞杆菌、不可培养菌、巴斯德梭菌、化糖梭状芽胞杆菌,青少年组和中年组组内亲缘性低,老年组和长寿组组内亲缘性高；四个年龄组组间肠道中的双歧杆菌亲缘性都较高,主要差异菌株是：两歧双岐杆菌、嗜热双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、不可培养双歧杆菌、齿双歧杆菌和青春双歧杆菌,四个年龄组组内肠道中的双歧杆菌亲缘性都较高;青少年组和长寿组组间肠道中的乳酸杆菌亲缘性较高,与中年组和老年组亲缘性低,且中年组和老年组组间亲缘性较高,主要差异菌株是：瑞士乳杆菌、瘤胃乳杆菌、罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、布赫内氏乳杆菌、植物乳杆菌和约氏乳杆菌,四个年龄组组内肠道中的乳酸杆菌亲缘性都较高。3.应用RT-PCR技术研究巴马长寿村不同年龄人群肠道菌群的差异。结果表明,中年组、长寿组及老年组肠道中肠杆菌数量分别为8.16±0.291gcopies/g、7.93±0.57 lgcopies/g及7.89±0.421gcopies/g,其中中年组显著高于青少年组的7.46±0.32 lgcopies/g(P0.05)；中年组和老年组肠道中的肠球菌的数量分别为7.06±0.44 lgcopies/g、7.89±0.331gcopies/g,均显著高于青少年组的7.06±0.441gcopies/g和长寿组的6.93±0.371gcopies/g(P0.05)；青少年组和中年组肠道中的柔嫩梭菌数量分别是9.06±0.441gcopies/g 8.91±0.171gcopies/g,均显著高于老年组的8.42±0.231gcopies/g和长寿组的8.13±0.261gcopies/g(P0.05)；长寿组和青少年组肠道中的乳杆菌数量分别为8.63±0.381gcopies/g和8.36±0.481gcopies/g,其中长寿组显著高于中年组的7.85±0.211gcopies/g和老年组的7.98±0.221gcopies/g(P0.05)；青少年组和长寿组肠道中的拟杆菌数量分别为9.76±0.351gcopies/g、9.53±0.281gcopies/g,其中青少年组显著高于中年组的9.23±0.171gcopies/g及老年组的8.92±0.321gcopies/g(P0.05)；长寿组和青少年组肠道中的双歧杆菌数量分别为10.52±0.391gcopies/g、 10.05±0.46 lgcopies/g,均显著高于中年组的8.86±0.411gcopies/g和老年组的8.33±0.92lgcopies/g(P0.05),且双歧杆菌的数量略高于拟杆菌的数量,显著高于其它4种优势菌属(P0.05)。
【关键词】：长寿地区 年龄 肠道菌群
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R333
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 符号说明10-11
• 1 绪论11-23
• 1.1 人体肠道菌群11-15
• 1.1.1 人体肠道菌群的结构组成11-13
• 1.1.2 人体肠道菌群的主要功能13-14
• 1.1.3 人体肠道菌群与年龄关系的研究进展14-15
• 1.2 肠道菌群的研究方法15-17
• 1.2.1 肠道乳酸菌的纯培养法15
• 1.2.2 变性梯度凝胶电泳15-16
• 1.2.3 实时荧光定量16-17
• 1.2.4 其他研究肠道菌群的分子生物学技术17
• 1.3 研究目的、意义及主要内容17-18
• 1.3.1 研究目的与意义17-18
• 1.3.2 主要研究内容18
• 1.4 参考文献18-23
• 2 应用纯培养法研究分离自广西巴马不同年龄人群肠道的乳酸菌数量及其耐受性和抑菌能力23-35
• 2.1 材料和设备23
• 2.1.1 主要仪器和设备23
• 2.1.2 试剂与材料23
• 2.2 试验方法23-27
• 2.2.1 溶液及培养基的配制23-24
• 2.2.2 样品采集及保存24
• 2.2.3 肠道乳酸菌的分离与计数24-25
• 2.2.4 肠道乳酸菌的初步鉴定25-26
• 2.2.5 肠道乳酸菌的保藏26
• 2.2.6 肠道乳酸菌耐胆盐能力的测定26
• 2.2.7 肠道乳酸菌耐受人工胃液能力的测定26
• 2.2.8 肠道乳酸菌耐受人工肠液能力的测定26-27
• 2.2.9 肠道乳酸菌抑制致病菌能力的测定27
• 2.2.10 统计学处理27
• 2.3 结果与分析27-32
• 2.3.1 样品信息27-28
• 2.3.2 肠道乳酸菌的分离及初步鉴定28-30
• 2.3.3 分离的不同年龄人群肠道乳酸菌总数的比较30-31
• 2.3.4 分离的不同年龄人群的肠道乳酸菌的耐受能力的比较31
• 2.3.5 分离的不同年龄人群肠道乳酸菌对致病菌的抑制能力比较31-32
• 2.4 小结32-33
• 2.5 参考文献33-35
• 3 应用PCR-DGGE技术研究广西巴马不同年龄人群肠道菌群35-54
• 3.1 材料和设备35
• 3.1.1 主要仪器和设备35
• 3.1.2 试剂与材料35
• 3.2 试验方法35-41
• 3.2.1 常用溶液或试剂的配制35-36
• 3.2.2 粪便样品的采集36
• 3.2.3 粪便样品基因组DNA的提取36-37
• 3.2.4 粪便菌群组成的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析37-39
• 3.2.5 DGGE胶优势条带的回收及克隆测序39-41
• 3.2.6 PCR-DGGE条带分析41
• 3.3 结果与分析41-51
• 3.3.1 优势菌群DGGE结果分析41-43
• 3.3.2 拟杆菌DGGE结果分析43-45
• 3.3.3 柔嫩梭菌属DGGE结果分析45-47
• 3.3.4 双歧杆菌DGGE结果分析47-49
• 3.3.5 乳杆菌DGGE结果分析49-51
• 3.4 小结51-52
• 3.5 参考文献52-54
• 4 应用RT-PCR技术研究广西巴马不同年龄人群肠道菌群54-63
• 4.1 材料和设备54
• 4.1.1 主要仪器和设备54
• 4.1.2 试剂与材料54
• 4.2 试验方法54-57
• 4.2.1 粪便样品的采集54
• 4.2.2 粪便样品基因组DNA的提取54
• 4.2.3 引物的设计及合成54-55
• 4.2.4 常规PCR反应55
• 4.2.5 RT-PCR反应55-57
• 4.2.6 待测样品的定量57
• 4.2.7 统计学处理57
• 4.3 结果与分析57-60
• 4.3.1 人体肠道细菌RT-PCR标准曲线57-59
• 4.3.2 不同年龄人群粪便细菌定量结果59-60
• 4.4 小结60-61
• 4.5 参考文献61-63
• 5 结论63-64
• 6 致谢64-65
• 攻读学位期间发表的学术论文目录65-66

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