轮状病毒单克隆抗体的制备

发布时间：2017-05-02 19:10

  本文关键词：轮状病毒单克隆抗体的制备，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：轮状病毒是引发全世界儿童严重腹泻的重要因素,该病毒引发的感染不仅严重影响婴幼儿的健康及生存质量,还给家庭及社会带来巨大的经济负担,由此可见,轮状病毒感染已经在世界范围内成为一项亟待解决的重要公共卫生问题。目前尚没有治疗轮状病毒感染的特效药,因此,研究一种快速并准确的轮状病毒早期检测方法,对于该病毒的防治具有深远的意义。单克隆抗体具有特异性强,灵敏度高的特点,如果将其应用于轮状病毒检测方法,则可对轮状病毒感染患者进行及时的诊断。本课题致力于制备抗轮状病毒的单克隆抗体,为建立一种高效的轮状病毒诊断检测方法提供基本依据。论文的第一章介绍了与轮状病毒相关的基础知识,包括病毒的形状及生物学特性,还综述了近年来轮状病毒的常见检测手段,并且根据自己的实验工作经验总结陈述了单克隆抗体制备过程中的影响因素。由于单克隆抗体的制备实验周期较长,实验步骤较多,一旦出现问题,会直接影响最终的结果,因此这一部分还列举了实验各个环节的注意事项,以避免相关人员在研究过程中出现较多问题。论文第二章通过考察各个环节的实验条件,包括抗原、血清的稀释倍数,封闭液的选择、封闭条件的确定,酶标二抗的包被时间以及底物液的显色时间。建立了一种针对轮状病毒蛋白质的ELISA检测方法,便于在单克隆抗体的制备过程中进行相关抗体的检测。论文第三章介绍了通过细胞融合获得单克隆杂交瘤细胞的过程,包括小鼠的免疫、细胞融合、阳性杂交瘤的筛选和培养以及单克隆杂交瘤的获得。本课题最终得到了五株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株:1B3-A2、1B3-C3、2B4-A9、3D19-C2、4E22-B10。论文第四章研究了大量制备单克隆抗体后,对该抗体进行纯化,并且进一步考察了抗体纯化后浓度、特异性以及生物学特性。通过单克隆抗体叠加实验,可得出除1B3-A2和4E22-B10两株单克隆杂交瘤细胞分泌的抗体有可能针对相同的抗原表位,1B3-C3、2B4-A9、3D19-C2等单克隆抗体均可能针对不同的抗原表位。
【关键词】：轮状病毒 单克隆抗体 细胞融合 杂交瘤
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 前言9-11
• 第1章 文献综述11-30
• 1.1 轮状病毒概述11-17
• 1.1.1 轮状病毒的外形特征11-12
• 1.1.2 轮状病毒主要抗原的生物学特性12-15
• 1.1.3 致病机制15-16
• 1.1.4 轮状病毒的流行病学特点16-17
• 1.2 轮状病毒检测方法的研究进展17-20
• 1.2.1 经典检测技术17-18
• 1.2.2 免疫检测技术18-19
• 1.2.3 基因检测技术19-20
• 1.3 单克隆抗体概述20-28
• 1.3.1 抗体的结构及其性质20-21
• 1.3.2 单克隆抗体制备的影响因素21-28
• 1.4 本课题的研究目的和意义28-30
• 第2章 ELISA检测方法的建立30-41
• 2.1 仪器与试剂30-32
• 2.1.1 主要试剂30-31
• 2.1.2 主要仪器31
• 2.1.3 主要溶液的配制31-32
• 2.2 实验方法32-34
• 2.2.1 阳性血清与阴性血清的制备32
• 2.2.2 抗原包被最佳浓度与对照血清最佳稀释度的确定32-33
• 2.2.3 最佳封闭条件确定33-34
• 2.2.4 酶标二抗最佳作用时间的确定34
• 2.2.5 底物液最佳作用时间的确定34
• 2.3 结果与讨论34-39
• 2.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定34-35
• 2.3.2 最佳封闭条件的确定35-37
• 2.3.3 酶标二抗最佳作用时间的确定37-38
• 2.3.4 底物液最佳作用时间的确定38-39
• 2.4 本章小结39-41
• 第3章 单克隆杂交瘤的制备41-60
• 3.1 材料仪器与试剂41-44
• 3.1.1 主要试剂41-42
• 3.1.2 主要仪器42
• 3.1.3 主要溶液的配制42-44
• 3.2 实验方法44-52
• 3.2.1 BALB/C小鼠的免疫44-46
• 3.2.2 ELISA测定小鼠血清效价46
• 3.2.3 蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测抗血清特异性46-48
• 3.2.4 细胞融合48-50
• 3.2.5 杂交瘤细胞株的建立和筛选50
• 3.2.6 杂交瘤细胞的单克隆及扩大培养50-51
• 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的冻存和复苏51
• 3.2.8 单克隆杂交瘤细胞的定性检测51-52
• 3.3 结果与讨论52-59
• 3.3.1 小鼠的免疫52-54
• 3.3.2 细胞融合54-55
• 3.3.3 阳性杂交瘤的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立55-57
• 3.3.4 单克隆杂交瘤细胞的定性检测57-59
• 3.4 本章小结59-60
• 第4章 单克隆抗体的制备纯化及鉴定60-72
• 4.1 仪器与试剂60-62
• 4.1.1 主要试剂60-61
• 4.1.2 主要仪器61
• 4.1.3 主要溶液的配制61-62
• 4.2 实验方法62-66
• 4.2.1 单克隆抗体亚型的鉴定62-63
• 4.2.2 抗体的制备和纯化63-64
• 4.2.3 抗体效价的测定64
• 4.2.4 SDS-PAGE分析抗体纯度64
• 4.2.5 抗体浓度的测定64
• 4.2.6 单克隆杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定64-65
• 4.2.7 单克隆抗体特异性分析65-66
• 4.3 结果与讨论66-71
• 4.3.1 单克隆抗体亚型的鉴定66-67
• 4.3.2 抗体效价的测定67
• 4.3.3 抗体的鉴定67-68
• 4.3.4 抗体浓度的测定68-69
• 4.3.5 单克隆杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定69
• 4.3.6 单克隆抗体特异性分析69-71
• 4.4 本章小结71-72
• 结论72-74
• 参考文献74-78
• 附录78-80
• 致谢80-81
• 攻读学位期间发表的学术论文81-82

【参考文献】

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本文编号：341527