H7N9大流行流感疫苗Vero细胞高产毒株的生物学特性及其制备工艺研究

发布时间：2021-09-25 14:58

　　H7N9流感病毒已在一些国家和地区传播[1,3]。人感染H7N9禽流感病毒后死亡率高达30%。研究发现,病毒对人呼吸道上皮细胞主要受体α-2,6-唾液酸的亲和力不断增加[4.5],且部分毒株对现行的抗病毒药物已经产生了耐药性[4,6-8],WHO将H7N9禽流感病毒列为潜在的大流行流感病毒[7]。因此,研制人用H7N9禽流感疫苗具有重要战略意义。目前国内流感疫苗生产用病毒种子批均是从国外获得,如果将高致病禽流感病毒H7N9改造成疫苗株再返回国内用于疫苗生产,则我们很可能会错过防控流感大流行的最佳时机。此外,大多数现行流感疫苗基本是采用鸡胚生产,鸡胚供应周期长,尤其是当高致病性禽流感爆发时,种鸡有可能感染病毒死亡进而加剧鸡胚供应不足,造成疫苗生产困难。与鸡胚相比,非洲绿源猴肾细胞（Vero）可以采用发酵罐培养,易实现大规模生产和质量控制且具有较高安全性,适合用于疫苗生产。但流感病毒流行株在Vero细胞上产量不稳定,阻碍Vero细胞流感疫苗的研发[9,10]。因此,我们开展研究,通过解决流感病毒在Vero细胞上产量不稳定问题研发出具有自主知识产权的Vero细胞H7N9大流行流感疫苗。首先,... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１．１反向遗传学拯救病毒技术路线图??

３．１．２含流感病毒基因组载体构建??将酶切过后的经过胶回收的空载ｐＨＷ２０００载体使用１?％浓度的琼脂糖凝胶进行??鉴定，如图１．３中所示，自然状态下ＤＮＡ存在超螺旋，开环，环状三种状态。链??状ＤＮＡ在相同的电泳环境中移动速度较环状ＤＮＡ慢，环状ＤＮＡ较超螺旋ＤＮＡ??慢。经过限制性内切酶切割的链状ＤＮＡ为单一的条带，与阴性（未切割）的质粒??相比（图中条带较暗），酶切后的载体条带位置发生变化，比较靠近电泳起始的位??置，与自然状态下的开环质粒在此电泳图中的位置相似，证明空载ＰＨＷ２０００质粒??切割完全。??１８??

２９３Ｔ细胞是经改造后能够表达ＳＶ４０大Ｔ抗原的人胚肾上皮细胞，目前被广泛??用于转染表达各种目标蛋白或者是包装各类病毒。转染前，铺设的６孔板孔内细胞??经过１６小时的培养，生长到４０％－６０％的状态，如图１．４Ａ，选取Ｈ７Ｎ９病毒ＨＡ、??ＮＡ多份质粒进行组合（如表１．７）转染２９３Ｔ细胞，转染后在３７°Ｃ，?５％Ｃ０２培养箱??培养。观察细胞发现转染后２４小时密度增加到约８０％?（图１．４Ｂ），转染后４８小时??候细胞长满密集单层（图１．４Ｃ）。转染后７２小时对转染细胞培养液进行收获，此??时细胞培养液颜色变浅，部分细胞已经出现漂浮。??１９??

【参考文献】：
期刊论文
[1]ELISA法检测H3N2亚型流感病毒Vero细胞适应株[J]. 卢勇,宋绍辉,蔡玮,马磊,吴雅楠,李卫东,廖国阳.  现代生物医学进展. 2013(10)
[2]流感疫苗血凝素含量测定替代方法在甲型H1N1流感疫苗研发中的应用[J]. 邵铭,袁力勇,刘书珍,方捍华,李凤祥,胡忠玉,李长贵,王军志.  药物分析杂志. 2012(02)

博士论文
[1]微载体生物反应器培养Vero细胞和甲型流感病毒制备流感灭活疫苗的研究[D]. 周健.北京协和医学院 2017

硕士论文
[1]流感病毒H3N2亚型Vero细胞适应株基因克隆及相关基因突变位点分析[D]. 罗振武.中国协和医科大学 2008



本文编号：3409943